心肌梗塞（MI）是一種常見的由心臟或冠狀動(dòng)脈持續(xù)缺血引起的并發(fā)癥。心臟纖維化是一種細(xì)胞外基質(zhì)重塑及成纖維細(xì)胞激活的過(guò)程，在心肌梗死在內(nèi)的大多數(shù)心臟損傷中均存在。雖然早期心臟纖維化可防止心肌梗死期間梗死的心臟組織破裂，但是持續(xù)心臟纖維化常與患者不良預(yù)后相關(guān)，最終導(dǎo)致心力衰竭。乳酸是糖酵解的一種普遍存在的中間產(chǎn)物，以前被認(rèn)為是代謝的副產(chǎn)物。隨著研究的不斷深入，乳酸參與包括腫瘤進(jìn)展及膿毒血癥等多種疾病進(jìn)展。臨床研究表明，高乳酸水平與心臟病患者死亡率增加相關(guān)。此外，乳酸還可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化和肺纖維化。趙英明教授團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果顯示糖酵解來(lái)源的乳酸可以直接改變組蛋白的乳酸化修飾水平，通過(guò)在其賴氨酸參加添加乳酸基團(tuán)，這一過(guò)程也被稱為乳酸化修飾。先前研究顯示這種表觀遺傳修飾在心臟纖維期間參與調(diào)控促纖維化基因的表達(dá)。但是乳酸化修飾是否參與心肌缺血后心臟纖維化進(jìn)展仍不清楚。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Endothelial-to-mesenchymaltransition, EndoMT）是指上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的細(xì)胞的和分子改變，向間質(zhì)細(xì)胞例如肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程。心肌缺氧引起的MI可以促進(jìn)EndoMT，導(dǎo)致心臟纖維化，從而引起心臟功能障礙。先前的研究表明，EndoMT促進(jìn)MI后的心臟纖維化，抑制EndoMT可以減弱心臟的纖維化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor–β, TGF-β）被認(rèn)為在EndoMT相關(guān)的多種心血管疾病纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β信號(hào)的激活Smad2/3的磷酸化，以及EndoMT促進(jìn)Snail1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

臨床研究表明，高乳酸水平在心力衰竭患者中普遍存在，并與心力衰竭的死亡率相關(guān)。在本研究中，作者探究了MI是否可以增加循環(huán)乳酸水平。如圖1（A至F）所示，MI明顯提高了血清和心臟的乳酸水平，并且術(shù)后7天的心功能下降顯著。為了確定減少乳酸是否會(huì)改善心臟功能障礙和MI后心肌的纖維化過(guò)程，作者利用糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）來(lái)降低乳酸水平。2-DG抑制了由MI誘發(fā)的血清和心臟乳酸水平增加（圖1，A和B）。值得注意的是，與對(duì)照組相比，射血分?jǐn)?shù)（EF%）和短軸縮短率（FS%）的水平在2-DG處理的MI模型中顯著升高（圖1，C和D）。2-DG處理的MI小鼠模型的左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（LVESV）值低于對(duì)照組MI小鼠（圖1，E和F），表明抑制乳酸的產(chǎn)生可改善MI后的心臟功能（圖1，E和F）。此外，梅森三色染色顯示，2-DG可以降低MI后心臟纖維化程度（圖1G）。以上結(jié)果提示：乳酸的產(chǎn)生可能導(dǎo)致心肌梗死所致的纖維化和心功能不全。

為了證實(shí)乳酸在心臟功能障礙和纖維化中的作用，作者在誘導(dǎo)MI后3小時(shí)給小鼠補(bǔ)充了乳酸，并且在1和4周用超聲心動(dòng)圖評(píng)估MI后的心臟功能。圖1H顯示，腹腔注射乳酸（0.5克/公斤體重）7天后，血清乳酸濃度恢復(fù)到正常水平。因此，作者每7天通過(guò)腹腔注射乳酸鹽。與假手術(shù)組相比，MI顯著的降低了EF%和FS%的值（圖1，I和J）。與MI組相比，乳酸鹽的使用進(jìn)一步降低了EF%（7天時(shí)降低14.0%，28天時(shí)降低19.5%）和FS%（7天時(shí)降低15.8%，28天時(shí)降低21.6%）值（圖1，I和J）。同時(shí)，乳酸處理也增加了心肌梗死后左心室容積和左心室收縮率的水平（圖1，K和L）。此外，乳酸增加MI后小鼠心臟纖維化水平（圖1M）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，乳酸水平的增加會(huì)使MI后的心臟功能惡化。

為了研究乳酸如何增加MI后的心臟纖維化，作者接下來(lái)評(píng)估了乳酸和MI后的心臟內(nèi)皮細(xì)胞之間是否存在關(guān)聯(lián)。與假手術(shù)組相比，心肌梗死誘發(fā)了內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和VE-cadherin表達(dá)（圖2A和圖S4，A和B）以及間質(zhì)標(biāo)志物成纖維細(xì)胞特異性蛋白1 FSP1）、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）和Collagen1al表達(dá)的明顯增加（圖2A）。然而，通過(guò)給予2-DG抑制乳酸的產(chǎn)生，提高了CD31和VE-cadherin的表達(dá)，同時(shí)抑制了由MI誘發(fā)的Collagen1al、a-SMA和FSP1表達(dá)的增加（圖2A）。與此相應(yīng)，2-DG的處理也提高了內(nèi)皮標(biāo)志物Cdh5和Kdr的mRNA水平（圖2B）。相反，2-DG 下調(diào)了間質(zhì)標(biāo)志物Atca2、Collal、Fnl和 S100a4的mRNA表達(dá)（圖2B）。總之，這些數(shù)據(jù)表明抑制乳酸會(huì)減弱MI后的EndoMT。

作者還在內(nèi)皮細(xì)胞特異性綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的小鼠（TIE2GFP）中誘發(fā)了MI，輔以或不輔以2-DG，用抗GFP（綠色）和抗FSP1（紅色）抗體對(duì)心臟組織進(jìn)行免疫熒光染色。如圖2C所示，與假手術(shù)組相比，MI誘導(dǎo)了GFP與FSP1的共定位。相反，2-DG抑制乳酸的產(chǎn)生，可以減少MI誘導(dǎo)的GFP與FSP1的共定位，表明2-DG降低了MI誘導(dǎo)的EndoMT。此外，在MI或假手術(shù)7天后，作者從收獲的心臟中分離出內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢查內(nèi)皮細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的百分比，如圖2D所示，從假對(duì)照組分離的內(nèi)皮細(xì)胞小鼠顯示，大多數(shù)GFP細(xì)胞被抗CD31和抗CD114（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物）抗體所染色。Gp38是一個(gè)公認(rèn)的心臟成纖維細(xì)胞群的標(biāo)記（26）。圖2E顯示，從假對(duì)照小鼠心臟分離的內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎沒有檢測(cè)到Gp38染色。然而，MI明顯地促進(jìn)了GFP標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞中Gp38陽(yáng)性染色細(xì)胞的數(shù)量和百分比。相反，用2-DG處理抑制了MI誘導(dǎo)的Gp38陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞。

作者還研究了補(bǔ)充乳酸的產(chǎn)生是否能促進(jìn)MI后的EndoMT轉(zhuǎn)變。Western顯示，與MI組相比，補(bǔ)充乳酸會(huì)降低內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（CD31和VE-cadherin）的水平，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物（FSP1、a-SMA和Collagenla1）的表達(dá)（圖3A）。一致的是，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）顯示，乳酸水平的提高導(dǎo)致MI后Cdh5和Kdr mRNA水平的降低（圖3，B和C）以及Collal、Fn1和S100a4 mRNA水平的誘導(dǎo)（圖3，D至F），這表明乳酸誘導(dǎo)MI后EndoMT。

作者還在TIE2GFP小鼠體內(nèi)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MI小鼠中GFP與FSP1共定位（圖3G），并且乳酸處理后二者共定位的水平顯著增加（圖3G），表明乳酸處理后有更多的內(nèi)皮細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。作者還通過(guò)流式進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果同樣顯示乳酸處理后MI模型中表達(dá)GFP gp38  的細(xì)胞比例增加（圖3H），表明乳酸促進(jìn)MI后心肌EndoMT。

為了確定乳酸鹽促進(jìn)EndoMT過(guò)程的機(jī)制，作者利用內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行低氧處理。劃痕結(jié)果顯示低氧處理可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并且10mM乳酸處理后可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的遷移（圖4A）。EdU結(jié)果顯示乳酸可以促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖（圖4B）。作者還進(jìn)一步檢測(cè)了遷移細(xì)胞中VE-cadherin的水平，免疫熒光結(jié)果顯示低氧72小時(shí)后VE-cadherin表達(dá)降低，10mM乳酸處理后VE-cadherin表達(dá)進(jìn)一步降低（圖4B）。Western blot和qRT-PCR結(jié)果同樣顯示，乳酸處理可以顯著降低VE-cadherin的表達(dá)（圖4C和5C）。以上研究結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞在低氧條件下可以改變其表型。

為了探究在低氧條件下乳酸是否誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT，作者利用乳酸處理后檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的Marker。如圖5A所示，缺氧72小時(shí)后，內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)從典型的形狀變成了拉長(zhǎng)的紡錘形外觀。并且乳酸處理后細(xì)胞形態(tài)變化更加顯著。此外，拉長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)FSP1染色呈陽(yáng)性，對(duì)CD31染色呈陰性（圖5B）。缺氧處理后，給予乳酸會(huì)降低VE-cadherin的表達(dá)并誘導(dǎo)α-SMA的釋放。為了研究乳酸促進(jìn)的EndoMT是否會(huì)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，作者進(jìn)行了基于Matrigel的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成試驗(yàn)，結(jié)果顯示乳酸處理抑制了血管的生成（圖5D）。此外，通過(guò)膠原蛋白凝膠收縮試驗(yàn)作者進(jìn)一步證實(shí)，乳酸處理的內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧刺激后表現(xiàn)出類似間質(zhì)的功能，表現(xiàn)為膠原蛋白凝膠減少和收縮性增加（圖5E）。綜上以上結(jié)果表明：在低氧條件下乳酸可以誘導(dǎo)EndoMT。

為了確定乳酸鹽在缺氧后誘導(dǎo)EndoMT的機(jī)制，作者評(píng)估了TGF-β和Smad2/3的表達(dá)。體內(nèi)qRT-PCR顯示，乳酸增加了MI后心肌中Tgfb1和Smad2 mRNA的表達(dá)（圖6，A和B）。然而，Smad3的mRNA水平?jīng)]有顯著變化（圖6C）。此外，2-DG處理抑制了MI誘導(dǎo)的Tgfb1和Smad2 mRNA表達(dá)的增加（圖6D和E）。體外研究還表明，乳酸進(jìn)一步增加了人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和HCMECs由于缺氧所致的TGFB1和SMAD2 mRNA表達(dá)增加（圖6，F和G）。與基因表達(dá)水平相一致的是，低氧處理后乳酸處理使Smad2的磷酸化和TGF-β的表達(dá)上調(diào)，但并不影響Smad3的磷酸化（圖6H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，乳酸誘導(dǎo)的TGF-β/Smad2激活可能促進(jìn)低氧所致的EndoMT。

單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（MCTs）是一種雙向轉(zhuǎn)運(yùn)體，可通過(guò)漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸。在乳酸給藥前使用MCT抑制劑α-氰基-4-羥基肉桂酸酯（CHC），可以抑制乳酸處理導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)乳酸水平的增加（圖7A），表明細(xì)胞外乳酸通過(guò)MCTs運(yùn)輸?shù)絻?nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。此外，CHC處理還可以抑制低氧條件下乳酸誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力增加（圖7B）。免疫熒光染色顯示，CHC抑制了乳酸處理所致VE-cadherin表達(dá)的降低（圖7C），成管試驗(yàn)表明，CHC促進(jìn)了缺氧后的血管生成（圖7D）。CHC還抑制了乳酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮標(biāo)志物PECAM1、CDH5和KDR mRNA水平的下降（圖7，E至G），以及間質(zhì)標(biāo)志物ACTA2、FN1和COL1A1 mRNA水平的上升（圖7，H至J）。CHC處理也抑制了乳酸誘導(dǎo)的TGFB1和SMAD2 mRNA表達(dá)的增高（圖7，K和L）。

Snail1是TGF-β的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）方面發(fā)揮著重要作用。作者還研究了Snail1在乳酸誘導(dǎo)的EndoMT的作用。低氧不能改變Snail1的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。然而，低氧處理后Snail1的核表達(dá)增多。免疫熒光染色顯示，在低氧處理后，核Snail1陽(yáng)性染色增加，乳酸處理進(jìn)一步Snail1核染色（圖8B），這表明Snail1的核移位可能在乳酸促進(jìn)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。

Snail1核轉(zhuǎn)位的增加是否參與乳酸激活的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)。作者利用Snail1抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP），結(jié)果顯示Snail1參與TGFB1基因的表達(dá)，并且在低氧條件下乳酸處理后TGFB1基因表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)（圖8C）。乳酸促進(jìn)Snail1蛋白和TGFB1基因的相互作用。

作者研究結(jié)果顯示低氧可以誘導(dǎo)Snail1乳酸化修飾及乙酰化修飾。乳酸處理可以進(jìn)一步增加Snail1的乳酸化修飾和乙?；揎椝剑▓D8D），先前研究表明Snail1可以CBP/P300結(jié)合誘導(dǎo)其乙酰化修飾。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了該發(fā)現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)乳酸處理可以進(jìn)一步加強(qiáng)二者的相互作用（圖8D）。作者還利用CHC進(jìn)行處理，結(jié)果顯示CHC處理減弱了Snail1與CBP/P300的相互作用，并且降低了Snail1的乳酸化和乙酰化水平（圖8E）。反之，乳酸處理又可以逆轉(zhuǎn)上述改變（圖8F）。

作者還進(jìn)一步探究乳酸是否通過(guò)Snail1的激活來(lái)促進(jìn)EndoMT和TGF-β/Smad2的激活。沉默Snail1，可以逆轉(zhuǎn)低氧后乳酸誘導(dǎo)的CD31和VE-cadherin的表達(dá)下調(diào)（圖9A）。相反，抑制Snail1可以降低乳酸處理所致的間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和FSP1表達(dá)增加（圖9A）、SMAD2的磷酸化和TGF-β的激活 (圖9H）。作者qRT-PCR結(jié)果顯示Snail1的敲除增強(qiáng)了PECAM1、KDR和CDH5的mRNA水平（圖9，B至D），并且降低了ACTA2、COL1A1和S100A4的表達(dá)（圖9E至G）。此外，Snail1的沉默也減弱了SMAD2和TGFB1 mRNA的表達(dá)（圖9I和G）。

為了闡明Snail1是否在體內(nèi)EndoMT中發(fā)揮作用，作者評(píng)估了MI后心肌中Snail1的乳酸化修飾水平。如圖10（A和B）所示，MI明顯促進(jìn)了Snail1的乳酸化和乙?；?，并且增加了Snail1和CBP/p300之間的相互作用，乳酸處理后進(jìn)一步增強(qiáng)了Snail1和CBP/p300之間的相互作用（圖10A）。2DG處理又可以逆轉(zhuǎn)上述改變（圖10B）。作者還進(jìn)一步特異性的敲低了心肌中的Snail（圖10C和D），以探究其在改善心功能中的作用。Snail1的沉默逆轉(zhuǎn)了乳酸誘導(dǎo)的EF%和FS%水平降低，以及LVEDV和LVESV水平的增高，表明Snail1缺失可以促進(jìn)乳酸誘導(dǎo)的心功能紊亂。此外，Snail1的沉默提高了Cdh5和Kdr的mRNA表達(dá)（圖10，I和J），減少了Acta2、Fn1和S100a4的mRNA表達(dá)（圖10K至M 至M) ?？傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明Snail1通過(guò)激活TGFβ/Smad2信號(hào)在乳酸誘導(dǎo)的EndoMT中發(fā)揮重要作用。

乳酸促進(jìn)心臟纖維化并且通過(guò)促進(jìn)EndoMT加劇了心肌梗死后的心臟功能紊亂。低氧條件下乳酸通過(guò)激活TGFβ/Smad2信號(hào)促進(jìn)上皮細(xì)胞EndoMT。機(jī)制上，以MCT依賴的方式轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的乳酸會(huì)促進(jìn)CBP/p300 和 Snail1結(jié)合，促進(jìn)Snail1的乳酸化修飾。抑制Snail1可減少乳酸誘導(dǎo)的EndoMT和TGF-β/Smad2的激活?？傊?，乳酸作為一種重要的分子在MI后通過(guò)誘導(dǎo)Snail1 乳酸化修飾促進(jìn)心肌 EndoMT。