各種現(xiàn)代化免疫分析儀都使用一種或兩種新的免疫分析技術(shù),如:酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物素一親和素技術(shù)、化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)、熒光偏振技術(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)等,使免疫檢驗(yàn)手段更先進(jìn)、方法更可靠、結(jié)果更準(zhǔn)確、可與放射免疫分析技術(shù)相媲美。下面就國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的幾種自動(dòng)化免疫分析儀及其分析原理作一介紹。

一. 美國(guó)雅培公司的AXSYM全自動(dòng)快速免疫分析系統(tǒng)

該系統(tǒng)綜合使用了微粒子捕捉酶免疫分析技術(shù)(MEIA)、熒光偏振免疫分析技術(shù)(F凹的,可測(cè)定激素、腫瘤標(biāo)志物、肝炎、病毒標(biāo)志物、娃娛、維生素和各種治療藥物濃度等。

(一)微粒子捕捉酶免疫分析技術(shù)(MEIA)原理。

以雙抗體夾心法為例,介紹如下:已包被了抗體的塑料微珠試劑中,加入待測(cè)標(biāo)本后,經(jīng)溫育,再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體、形成抗體一抗原一酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。然后將其轉(zhuǎn)移到玻璃纖維柱上,用緩沖液洗滌,沒(méi)有結(jié)合的抗原、酶標(biāo)抗體被洗掉,結(jié)合抗原抗體的塑料微珠則被保留在纖維柱濾膜的上方。這時(shí)再加入底物,4-甲基傘型酣磷酸鹽(4-Mup)。酶標(biāo)抗體上的堿性磷酸酶將4Mup分解,脫磷酸后形成甲基傘型酣(4Mu),它在365nm激發(fā)光的照射下,發(fā)出448nm的熒光,經(jīng)過(guò)熒光讀數(shù)儀的記錄、放大,計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量。

(二)熒光偏振免疫分析技術(shù)(FPIA〉

這是一種均相熒光免疫分析法,主要用于測(cè)定小分子量物質(zhì),如藥物濃度測(cè)定。原理是:標(biāo)記在小分子抗原上的熒光素經(jīng)485m的激發(fā)偏振光照射后,吸收光能,越入激發(fā)狀態(tài),激發(fā)狀態(tài)的熒光素不穩(wěn)定,很快以發(fā)出光子的形式釋放能量而還原。發(fā)射出的光子經(jīng)過(guò)偏振儀形成525一550nm的偏振光,這一偏振光的強(qiáng)度與熒光素受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比,游離的熒光素標(biāo)記抗原,分子小,轉(zhuǎn)動(dòng)速度快,激發(fā)后發(fā)射的光子散向四面八方,因此通向偏振儀的光信號(hào)很弱,而與抗體大分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗原,因分子大,分子的轉(zhuǎn)動(dòng)慢,激發(fā)后產(chǎn)生的熒光比較集中,因此偏振光信號(hào)比未結(jié)合時(shí)強(qiáng)得多。在測(cè)定過(guò)程中待測(cè)抗原小分子、熒光標(biāo)記抗原小分子和特異性抗體大分子同時(shí)加入到一反應(yīng)杯中,經(jīng)過(guò)溫育,待測(cè)抗原和熒光標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與抗體結(jié)合。待測(cè)抗原越少,與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的量越少,而熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合量就越多,當(dāng)激發(fā)光照射時(shí),熒光偏振的程度與熒光標(biāo)記物分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比,而熒光標(biāo)記的小分子抗原與大分子抗體結(jié)合后,其分子的轉(zhuǎn)動(dòng)速度減慢,因此熒光偏振信號(hào)強(qiáng)。結(jié)果是待測(cè)抗原的濃度低,可以通過(guò)計(jì)算獲得其含量。

二. 美國(guó)拜耳公司ACS:180SE和ACS:CENTAUR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

該系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的測(cè)定方法。以吖啶酶為發(fā)光的標(biāo)記物,固相載體為極細(xì)小的磁性顆粒。其測(cè)定原理與放射免疫和酶聯(lián)免疫中的雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法相似。下面以雙抗體夾心法為例進(jìn)行介紹。

(一) 單克隆抗體包被磁性微粒:磁性微粒是以三氧化二鐵為核心,外包一薄層聚苯乙烯組成,直徑10-2OL由于磁性微粒體積小,幾千萬(wàn)顆微粒的表面積比等量的固相載體表面積大得多,可吸附更多的抗體,同時(shí)磁性微粒的核心是鐵,在磁場(chǎng)中很快下沉,因此容易進(jìn)行洗滌和分離。

(二) 抗原抗體結(jié)合:包被了單克隆抗體的磁性微粒中加入一定量的標(biāo)本后,標(biāo)本中的抗原與微粒上的抗體結(jié)合,再加上吖啶酶標(biāo)記的多克隆抗體,經(jīng)過(guò)溫育形成固相包被抗體－抗原－吖啶酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。

(三) 洗滌、分離:在電磁場(chǎng)中進(jìn)行3~5次洗滌后,很快將未結(jié)合的多余抗原和標(biāo)記抗體洗去。

(四) 加入氧化劑發(fā)光:經(jīng)過(guò)洗滌的磁性微粒中,加入氧化劑(H202)和pH糾正液(NaOH)使成堿性,這時(shí)吖啶酶在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光,由集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內(nèi)所產(chǎn)生的光子能,這部分光的積分與被測(cè)抗原的量成正比,可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。

三. 美國(guó)強(qiáng)生公司的Vitros ECi全自動(dòng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀系統(tǒng)

該系統(tǒng)由Arnerlite發(fā)展而來(lái),采用酶聯(lián)免疫技術(shù)、生物素親和素技術(shù)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它是用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗原或抗體、以子彈頭型塑料小孔管為固相載體,魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑,并加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑,可使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)、時(shí)間延長(zhǎng)而且穩(wěn)定。下面簡(jiǎn)單介紹其工作原理。

(一)在鏈霉親和素包被的子彈頭型塑料小孔管中,加入生物素標(biāo)記的特異性抗體和待測(cè)標(biāo)本,經(jīng)過(guò)37℃溫育,鏈霉親和素與生物素結(jié)合,特異性抗體與標(biāo)本中的抗原結(jié)合,形成鏈霉親和素一生物素一抗體一抗原復(fù)合物,經(jīng)過(guò)洗滌,將多余的標(biāo)本和生物素標(biāo)記抗體除去。

(二) 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體,經(jīng)37℃溫育,形成鏈霉親和素一生物素一抗體一抗原一酶標(biāo)抗體復(fù)合物,并固定在小孔管壁上。

(三) 加入氧化劑H202，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑和魯米諾,這時(shí)結(jié)合在固相載體上的辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化劑的作用下將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑亞鐵原吟琳激活,接著它催化并激活魯米諾發(fā)光,這種化學(xué)發(fā)光強(qiáng)渡比單獨(dú)魯米諾發(fā)光強(qiáng),持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),而且穩(wěn)定,易于測(cè)定。

(四) 魯米諾發(fā)光強(qiáng)度經(jīng)光量子記錄系統(tǒng)記錄,經(jīng)計(jì)算'從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出待測(cè)抗原含量。

四. 法國(guó)梅里埃公司的VIDAS全自動(dòng)熒光酶標(biāo)免疫測(cè)試系統(tǒng)

該系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體,用塑料吸管(SPR)為固相載體,以4-甲基傘型酬磷酸鹽(4-MIjP)為發(fā)光劑,其測(cè)定原理及過(guò)程以雙抗體夾心法描述如下:

(一) 將待測(cè)標(biāo)本加入多孔試劑條的樣本孔內(nèi),然后將多孔試劑條插入儀器內(nèi)。

(二) 將單克隆抗體包被的塑料吸嘴SRP(其形態(tài)與加樣器的吸頭相似),插入多孔試劑條的上方。

(三) 儀器自動(dòng)將待測(cè)樣本來(lái)回多次吸入塑料吸嘴,以促抗原抗體反應(yīng),經(jīng)溫育后吸入緩沖液進(jìn)行洗滌。

(四) 然后來(lái)回多次吸入堿性磷酸酶標(biāo)記抗體,使塑料吸嘴內(nèi)表面形成包被抗體一抗原一酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)溫育后進(jìn)行洗滌。

(五) 最后加入底物4-甲基傘型酣磷酸鹽,它被酶標(biāo)抗體上的堿性磷酸酶分解,脫磷酸形成4-甲基傘型酣,經(jīng)370nm激光照射下,發(fā)出450nm的熒光,經(jīng)熒光讀數(shù)儀記錄,并計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量

五. 美國(guó)貝克曼公司(Beclunarl)的Access全自動(dòng)微粒子酶放大化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

是由美國(guó)貝克曼公司和法國(guó)巴斯德研究院合作設(shè)計(jì)生產(chǎn)的。該系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體、以磁性微粒子為固相載體,用AMPPD(Diomums)作為化學(xué)發(fā)光劑,這種化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),因此比閃爍發(fā)光容易控制。其測(cè)定原理和過(guò)程簡(jiǎn)述如下:

(一) 單克隆抗體包被磁性微粒L微粒直徑<7μ(其余同ACS:180)。

(二) 抗原抗體結(jié)合:包被單克隆抗體的磁性微粒中加入標(biāo)本后,標(biāo)本中的抗原與微粒表面的抗體結(jié)合,再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體,經(jīng)溫育后形成固相包被抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。

(三) 洗滌、分離:同ACS:180

(四) 加入底物AMPPD發(fā)光劑:AMPPD在酶標(biāo)記抗體上的堿性磷酸酶催化作用下,迅速去磷酸,生成不穩(wěn)定的中介體AMPD。AMPD很快分解,從高能激發(fā)態(tài),回到低能量的穩(wěn)定態(tài),同時(shí)發(fā)射出光子,這種化學(xué)發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定,可達(dá)數(shù)小時(shí)之久。通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度,并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的濃度。

六.美國(guó)DPC公司(Diagnostic products corporation)的I刷ULITE2000型全自動(dòng)酶放大化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

該系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體,用Dioxetarl作為發(fā)光物質(zhì),以塑料珠為固相載體。測(cè)定原理與貝克曼公司的Access基本相同。

發(fā)光物質(zhì)Dioxetane phosphate的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)重要部分:一個(gè)是聯(lián)接苯環(huán)和金剛炕的二氧四節(jié)環(huán),它可以斷裂并發(fā)射光子:另一個(gè)是磷酸基團(tuán),它維持著整個(gè)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。當(dāng)有堿性磷酸酶存在時(shí),這種發(fā)光物質(zhì)作為酶的底物,在酶催化下脫去磷酸根的基團(tuán),形成一個(gè)不穩(wěn)定的中間體。這個(gè)中間體隨即自行分解(二氧四節(jié)環(huán)斷裂〉,同時(shí)發(fā)射光子。這種發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光穩(wěn)定,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。發(fā)光的強(qiáng)度與堿性磷酸酶的量成正比,因此可計(jì)算出標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)的濃度。

七. 美國(guó)EG&G Wallac公司的auto DELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)

該系統(tǒng)用制系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物,并與時(shí)間分辨熒光測(cè)定技術(shù)(TRFIA)相結(jié)合,建立了一種新的非放射性微量分析技術(shù),具有靈敏度高,示蹤物發(fā)光穩(wěn)定,不受樣品自然熒光干擾,標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬,檢測(cè)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

(一)制系元素?zé)晒夤庾V的特點(diǎn):

通常熒光光譜分兩部分,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。普通物質(zhì)產(chǎn)生的熒光光譜Stokes位移較小,因此激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊,互相干擾。而常見(jiàn)的游離鍋系元素?zé)晒庑盘?hào)也很弱,但當(dāng)它與有機(jī)配合體結(jié)合后,分子內(nèi)和分子間能量傳遞,使熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),而且稀土離子(包括制系元素)的熒光光譜有較大的Stokes位移(約290nm),使激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不會(huì)互相重疊。另外稀土離子發(fā)射光譜的峰相當(dāng)窄,特異性很強(qiáng),熒光壽命長(zhǎng),比普通熒光高出幾個(gè)數(shù)量級(jí),因此可以采用延緩測(cè)量時(shí)間的方式來(lái)降低樣品和試劑的本底熒光干擾,提高了測(cè)定的精密度。

(二)時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)原理:

時(shí)間分辨熒光免疫分析法使用的示蹤物是三價(jià)稀土離子如:銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等,它們可利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的整合劑,在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結(jié)合,形成稀土離子－整合劑-抗原結(jié)合物。當(dāng)標(biāo)記稀土離子的抗原與待測(cè)抗原共同與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,形成抗原抗體免疫復(fù)合物,其中含有標(biāo)記的稀土離子,然后利用時(shí)間分辨熒光分析儀,可測(cè)出復(fù)合物中稀土離子發(fā)射熒光的強(qiáng)度,以此確定待測(cè)抗原的含量,也即固相競(jìng)爭(zhēng)法。時(shí)間分辨免疫熒光分析法(TRIm)的原理是將稀土離子通過(guò)整合劑與抗體分子上的游離氨基共價(jià)結(jié)合,形成稀土離子－整合劑－抗體結(jié)合物,用于建立雙抗體夾心免疫分析法。

八.瑞士羅氏公司ES300型全自動(dòng)酶免分析儀。

該儀器系用酶聯(lián)免疫分析技術(shù),生物素一親和素技術(shù),以鏈霉親和素包被的塑料管為固相載體,顯色劑底物是ABTS。其測(cè)定原理和過(guò)程(以兩步夾心法為例)簡(jiǎn)述如下。

(一) 將鏈霉親和素包被的聚苯乙烯塑料試管置于儀器內(nèi)。

(二) 將生物素標(biāo)記的特異性抗體和待測(cè)抗原力日入鏈霉親和素包被試管內(nèi),經(jīng)溫育,生物素和親和素發(fā)生連接,待測(cè)抗原與特異性抗體發(fā)生結(jié)合,形成了固相包被親和素一生物素一特異性抗體一待測(cè)抗原復(fù)合物,然后進(jìn)行洗滌,去除未結(jié)合的抗原和生物素標(biāo)記抗體。

(三) 加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性抗體(酶標(biāo)抗體)經(jīng)溫育形成固相包被鏈霉親和素－生物素－特異性抗體－待測(cè)抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物,再次進(jìn)行洗滌,除去多余的酶標(biāo)抗體。

(四) 加入底物ABTS和H202，經(jīng)溫育,ABTS在辣根過(guò)氧化物酶的作用下,氧化呈現(xiàn)藍(lán)色,然后吸入流動(dòng)比色杯,經(jīng)422nm的酶標(biāo)儀測(cè)定獲得OD值,經(jīng)計(jì)算可得出待測(cè)抗原的含量。

九.瑞士羅氏公司ELECSYS 1010和ELECSYS2010型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

該系統(tǒng)采用世界上最先進(jìn)的電化學(xué)發(fā)光技術(shù),生物素一親和素技術(shù),并以磁性微粒為固相載體。電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(ECLIA)是繼放射免疫、酶聯(lián)免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫以后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù),是電化學(xué)發(fā)光和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物。電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物發(fā)光的原理與一般化學(xué)發(fā)光不同,是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。ECLIA的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,測(cè)定速度快、線性范圍寬、結(jié)果穩(wěn)定、自動(dòng)化程度高、試劑保存期長(zhǎng),應(yīng)用范圍廣等。

(一)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)原理:

化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru (bpy)3]+和電子供體三丙胺(TPA)在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru (bpy)3]2+被氧化成三價(jià),這是一種強(qiáng)氧化劑。TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+·,它很不穩(wěn)定,可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子(H+),形成自由基TPA·,這是一種很強(qiáng)的還原劑,可將一個(gè)電子給蘭價(jià)的[Ru (bpy)J+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+·。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)620nm的光子,回復(fù)成基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程可以在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行,產(chǎn)生許多光子,使光信號(hào)增強(qiáng)。

(二)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)模式(以雙抗體夾心法為例):

1.首先將特異性抗體包被在磁性微珠上。另外將發(fā)光劑[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記在特異性抗體上。

2.將待測(cè)樣本與包被抗體的磁性微珠和發(fā)光劑標(biāo)記的抗體共同溫育,形成磁性微珠包被抗體-抗原-發(fā)光劑標(biāo)記抗體復(fù)合物。

3.將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室,同時(shí)加入TPA緩沖液。當(dāng)磁性顆粒復(fù)合物流經(jīng)電極表面時(shí),被安裝在電極下面的磁鐵吸引,使[Ru(bpy)3]2+和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。

4.這一反應(yīng)模式中還可引入生物素－親和素技術(shù),使靈敏度更高。