不同病毒比較

LV-ADV-AAV比較

滴度

• 慢病毒：TU/ml
• 腺病毒：PFU/ml
• 腺相關(guān)病毒：vp/ml

AAV

AAV是一種單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科，Dependoparvovirus屬。它的生命周期依賴于輔助病毒的存在，例如AdV。AAV存在于多種脊椎動(dòng)物中，包括人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(NHP)。目前的共識(shí)認(rèn)為AAV不會(huì)引起任何人類疾病。
它由直徑約26nm的二十面體蛋白質(zhì)衣殼和~4.7 kb的單鏈DNA基因組組成。衣殼包含三種類型的亞基VP1、VP2和VP3，總共60種拷貝，比例為1:1:10 (VP1:VP2:VP3)?；蚪M的兩端是兩個(gè)T形反向末端重復(fù)序列(ITR)，這兩個(gè)ITR是AAV的DNA自我復(fù)制的起點(diǎn)以及觸發(fā)病毒包裝的信號(hào)，在病毒的復(fù)制和包裝過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并且參與了病毒基因組在宿主基因組上的整合和逃逸過(guò)程。

AAV和AAV載體示意圖

ITR序列示意圖

腺相關(guān)病毒包裝：

• 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是一類無(wú)法自主復(fù)制的二十面體微小病毒。通常情況下，只有在輔助病毒的參與下，才能進(jìn)行復(fù)制。腺相關(guān)病毒（AAV）載體系統(tǒng)是對(duì)腺相關(guān)病毒進(jìn)行優(yōu)化的一種基因傳遞系統(tǒng)。AAV重組載體構(gòu)建完成后與輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞，包裝成病毒顆粒。純化后，轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞，線性雙鏈DNA基因組以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。輔助質(zhì)粒能夠代替輔助病毒，幫助AVV實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制，從而提高載體系統(tǒng)的生物安全性。

幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：

• 克隆的容量在2.8kb左右（因?yàn)楸旧砘蚪M僅4.7kb，還要加上基本元件）
• 但是AAV的滴度較高，可以達(dá)到13次方。
• 血清型：即為抗血清的類型，不同的AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)，因而其識(shí)別與結(jié)合的細(xì)胞表面受體不同，這也導(dǎo)致不同血清型AAV感染效率/組織親嗜性/表達(dá)時(shí)間不同
• 自互補(bǔ)AAV（self-complementary AAV）經(jīng)過(guò)ITR改造，不必像傳統(tǒng)單鏈AAV經(jīng)過(guò)基因組的第二鏈合成才能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，在多種靶向組織中表現(xiàn)出快速、高效、長(zhǎng)期的表達(dá)。

1. 優(yōu)勢(shì)：表達(dá)速度快；表達(dá)效率高；
2. 局限： 載體容量小，僅為rAAV的一半；純度問(wèn)題；

目前研究的腺相關(guān)病毒都是重組的腺相關(guān)病毒（rAAV）,主要是利用AAV2型基因組與不同血清型衣殼蛋白進(jìn)行組裝，以進(jìn)一步確保AAV的安全性。
你只需要三個(gè)質(zhì)粒就可以開(kāi)始制作 AAV：

1. 包含結(jié)構(gòu)和包裝基因的包裝質(zhì)粒，
2. 包含病毒復(fù)制所需蛋白質(zhì)的腺病毒輔助質(zhì)粒，

3. 以及包含病毒基因組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。

   
   
   

   圖 1：AAV 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的部分。綠色部分是 AAV 質(zhì)粒的關(guān)鍵元素。以灰色顯示的部分是可選的順式調(diào)節(jié)元件

• 反向末端重復(fù) (ITR) 序列
  反向末端重復(fù)序列 (ITR) 使 AAV 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒成為 AAV 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。ITR 序列各有 145 個(gè)堿基，AAV 質(zhì)粒有兩個(gè) ITR 序列。ITR 之間的 DNA 序列被包裝到 AAV 分子中。ITR 之外的內(nèi)容不會(huì)打包到 AAV 向量中。ITR 之間的克隆容量約為 4.4 kb。由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)、回文性質(zhì)和高 GC 含量，ITR 本質(zhì)上是不穩(wěn)定的。這種不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致在常規(guī)質(zhì)粒傳播過(guò)程中 ITR 部分丟失，完全 ITR 丟失會(huì)取消 AAV 包裝。為了防止 ITR 丟失，最好在缺乏重組的細(xì)菌菌株（如 Stbl3s）中傳播 AAV 構(gòu)建體。ITR 丟失可以通過(guò)使用酶（如 SmaI）的限制性消化來(lái)檢測(cè)，這些酶在 ITR 中具有識(shí)別位點(diǎn)。由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)和高 GC 含量，常規(guī) Sanger 測(cè)序通常無(wú)法通過(guò) ITR 進(jìn)行測(cè)序，但一些公司現(xiàn)在提供 Sanger 測(cè)序條件，可以讀取這個(gè)具有挑戰(zhàn)性的序列。
• Transgene:轉(zhuǎn)基因是將由 AAV 傳遞的基因。在質(zhì)粒圖譜上，其序列位于 ITR 之間。只要大約 4.4 kb 或更小，它可以是您喜歡的任何內(nèi)容。一些例子包括像 GFP 這樣的報(bào)告基因、一些較小的 CRISPR-Cas 蛋白（如[SaCas9]、CRISPR gRNA）或您感興趣的基因。
• 順式作用元件：
  • Lox sites:Lox 位點(diǎn)與 Cre 重組酶結(jié)合使用，可在空間和時(shí)間上控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Lox 位點(diǎn)是定向的 34 bp 序列，可以位于轉(zhuǎn)基因兩側(cè)并位于 ITR 之間。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通常有兩對(duì) lox 位點(diǎn)，它們是稱為[FLEX]或 DIO的雙 lox 系統(tǒng)的一部分。Lox 位點(diǎn)被重組酶 Cre 識(shí)別。酶Cre第一FL IPS第一對(duì)lox位點(diǎn)，然后之間的序列前CISE第二對(duì)之間的序列。最終結(jié)果是永久翻轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)基因。通過(guò)限制 Cre 的可用性，lox 位點(diǎn)讓研究人員可以控制轉(zhuǎn)基因的空間和時(shí)間激活。
  • WPRE：土撥鼠肝炎病毒 (WHP) 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件 (WPRE) 在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于 mRNA 的核輸出并有助于增加轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。WPRE 位于 AAV 基因組的末端，就在最終 ITR 的上游。
  • Poly A:聚腺苷酸化或 polyA 信號(hào)有助于 RNA 和 RNA 翻譯的核輸出，并促進(jìn) RNA 轉(zhuǎn)錄本的壽命。polyA 位于 AAV 基因組的末端，就在最終 ITR 的上游和 WPRE 的下游。

引用知乎-馬小蘇-控制元件如啟動(dòng)子

引用知乎-馬小蘇

圖片來(lái)源：Semantic Scholar

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