通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）遞送CRISPR基因編輯工具，為開(kāi)發(fā)永久性逆轉(zhuǎn)致病基因缺陷的療法提供了巨大潛力。通過(guò)這種方式來(lái)靶向并敲入正?；蛐蛄幸曰謴?fù)基因功能，而不用管突變類(lèi)型，因此是一種很有吸引力的基因治療策略。

然而，想實(shí)現(xiàn)AAV-CRISPR有效在體內(nèi)細(xì)胞中的基因敲入，通常需要遞送高劑量AAV，這會(huì)帶來(lái)潛在安全風(fēng)險(xiǎn)，而且大大增加生產(chǎn)成本。

近日，香港中文大學(xué)馮波團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：Low-dose AAV-CRISPR-mediated liver-specific knock-in restored hemostasis in neonatal hemophilia B mice with subtle antibody response 的研究論文。

研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了AAV-CRISPR介導(dǎo)的體內(nèi)NHEJ基因敲入，實(shí)現(xiàn)了有效且更低和更安全劑量的AAV劑量，在成年和新生小鼠血友病B型模型中實(shí)現(xiàn)了有效的人源F9基因敲入，恢復(fù)了凝血因子Ⅸ的表達(dá)，從而恢復(fù)了血友病B型小鼠的凝血功能。

值得一提的是，在接受低劑量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血漿抗體幾乎可以忽略不計(jì)，這為AAV-CRISPR介導(dǎo)的體細(xì)胞基因敲入治療遺傳性疾病提供了支持。

由凝血因子Ⅸ（由F9基因表達(dá)）突變引起的遺傳性血友病B型被廣泛用作疾病模型來(lái)研究基因敲入。通過(guò)同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制，使用AAV遞送的鋅指核酸酶（ZFN）在小鼠體內(nèi)敲入人F9基因外顯子（hF9 Ex2-8），使用AAV遞送的CRISPR-SaCas9敲入小鼠mF9 Ex2-8和高活性hF9 R338L變體。

除了同源定向修復(fù)（HDR），DNA的另一種修復(fù)機(jī)制非同源末端連接（NHEJ）最近也被用于基因敲入，與HDR相比，基于NHEJ的基因敲入效率更高。由于無(wú)需同源序列，在進(jìn)行體內(nèi)基因編輯時(shí)，通過(guò)AAV遞送供體序列進(jìn)行NHEJ基因敲入具有潛力更大，也更具靈活性。

迄今為止，通過(guò)基于HDR或NHEJ的策略，AAV遞送的體內(nèi)基因敲入的效果已在臨床前模型中得到廣泛證實(shí)。然而，有效的體內(nèi)基因敲入大多是以高劑量AAV為代價(jià)的，這會(huì)顯著增加潛在安全風(fēng)險(xiǎn)和生產(chǎn)成本。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)在mAlb基因的3'UTR區(qū)域的新靶點(diǎn)進(jìn)行了AAV-CRISPR介導(dǎo)的不依賴于同源序列的基因敲入。單劑AAV成功在成年和新生血友病B型小鼠中實(shí)現(xiàn)了人源F9基因的長(zhǎng)期整合和表達(dá)，產(chǎn)生了高水平的人凝血因子因子Ⅸ（hFⅨ），并在整個(gè)48周的觀察期間穩(wěn)定地恢復(fù)凝血功能。

此外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用高活性hF9 R338L 變體的肝臟特異性基因敲入，以顯著降低的AAV劑量恢復(fù)了血友病B型小鼠的凝血功能（新生小鼠劑量為2×10E9 vg，成年小鼠為1×10E10 vg）。

在接受低劑量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血漿抗體幾乎可以忽略不計(jì)，這為AAV-CRISPR介導(dǎo)的體細(xì)胞基因敲入治療遺傳性疾病提供了支持。