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大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 多項(xiàng)研究已證明，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是癌癥診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。2022年08月23日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國(guó)家腫瘤中心吳志宏/佟仲生/赫捷/孫英麗團(tuán)隊(duì)在《Clin Transl Med 》雜志發(fā)表了題為“Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer”的研究文章，通過(guò)ctDNA全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）以低至1ng的微量input ctDNA 生成無(wú)偏倚的全基因組 ctDNA 甲基化圖譜，證明了ctDNA-WGBS測(cè)序分析用于癌癥的檢測(cè)和分子分型的可行性。
標(biāo)題：Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer（ctDNA全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序分析用于癌癥的檢測(cè)和分子分型） 發(fā)表期刊：Clinical and Translational Medicine 發(fā)表日期：2022年08月 影響因子：8.554/1區(qū) 方法：ctDNA-WGBS 摘要： 癌細(xì)胞特異性變異和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）甲基化是用于非侵入性癌癥檢測(cè)和分子分型的潛在生物標(biāo)志物。然而由于缺乏癌細(xì)胞特異性ctDNA、DNA變異信噪比低、缺乏非位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)等難點(diǎn)，ctDNA在癌癥早期檢測(cè)和篩查中的應(yīng)用仍具挑戰(zhàn)。 本研究納入中國(guó)兩家醫(yī)院的三組乳腺癌（breast cancer，BC）患者（BC組n=123；健康對(duì)照組n=40）。利用ctDNA全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)，ctDNA-WGBS具有從200μL血漿中微量ctDNA捕獲、微量input（1ng）文庫(kù)制備、無(wú)偏倚的全基因組覆蓋和全面計(jì)算方法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在多中心患者隊(duì)列中，包含15個(gè)ctDNA甲基化標(biāo)志物的診斷特征在早期（曲線下面積AUC=0.967）和晚期（AUC=0.971）BC階段顯示出高準(zhǔn)確性。同時(shí)研究結(jié)果還鑒定出可以在不同的癌癥類型（包括肝細(xì)胞癌和肺癌）重可以很好區(qū)分雌激素受體狀態(tài)的ctDNA甲基化特征（訓(xùn)練集AUC=0.984，測(cè)試集AUC=0.780）。 本研究為后續(xù)研究提供了一個(gè)工具集，即用微量血漿生成無(wú)偏倚的全基因組ctDNA甲基化組，為癌癥的早期診斷和分子分型開(kāi)發(fā)高度特異性和敏感性的生物標(biāo)志物。
圖形摘要 引言： 腫瘤細(xì)胞向血液中分泌稱為ctDNA的單鏈或雙鏈DNA片段，提供了一種新的診斷工具。ctDNA具有幾個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)：（1）用于ctDNA分析的血液采集快速簡(jiǎn)單。（2）ctDNA的半衰期(約2小時(shí)）使其能夠用于動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展。（3）ctDNA檢測(cè)減少了與腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性相關(guān)的偏倚。（4）ctDNA可以在醫(yī)學(xué)影像前幾個(gè)月檢測(cè)到復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，許多正在進(jìn)行的研究將ctDNA作為腫瘤早期診斷的非侵入性生物標(biāo)志物。癌癥相關(guān)基因的基因突變是潛在候選基因，可以通過(guò)既定方法在癌癥患者的血漿ctDNA中進(jìn)行分析，panel測(cè)序有了更多突變檢測(cè)的機(jī)會(huì)。但這種方法在癌癥篩查中存在三個(gè)主要挑戰(zhàn)：（1）對(duì)于早期癌癥，可接受的放血量上限和有限的ctDNA脫落可能影響敏感性。（2）白細(xì)胞DNA污染和非惡性/癌前過(guò)程（如年齡相關(guān)的克隆造血）的血漿ctDNA的突變可能影響檢測(cè)特異性。（3）突變的非組織特異性給癌癥病因帶來(lái)不確定性。因此，迫切需要找到一種新穎實(shí)用的方法來(lái)克服這些限制。 DNA甲基化變化可能是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的早期事件，使其成為早期癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。研究表明，與組織中的拷貝數(shù)變異相比，特異性DNA甲基化特征更能預(yù)測(cè)乳腺癌（BC）風(fēng)險(xiǎn)。人甲基化450芯片（HM450K）的DNA甲基化圖譜能夠以超過(guò)組織病理學(xué)的準(zhǔn)確度對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥分型，但450K芯片僅覆蓋基因組的0.1%–1%，癌癥特異性甲基化變化很容易被忽略，大大影響特異性和敏感性。簡(jiǎn)化甲基化亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）和甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）是檢測(cè)DNA甲基化的改進(jìn)方法，RRBS和MeDIP-seq顯著提高了DNA甲基化覆蓋率，可以達(dá)到全基因組的10%，且能夠區(qū)分各種癌癥類型，但RRBS和MeDIP-seq分別基于酶切和抗體免疫沉淀，獲得數(shù)據(jù)具有位點(diǎn)特異性。Low‐pass WGBS降低測(cè)序深度成本(約5M reads）的ctDNA WGBS測(cè)序，可以覆蓋GC富集區(qū)域，但全基因組特別是GC低的區(qū)域仍需要高深度測(cè)序。CpG區(qū)域覆蓋范圍有限，在DNA甲基化分析中忽略了CG低的信息，導(dǎo)致癌癥特異性信息丟失。DNA重亞硫酸鹽處理將DNA中未修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，同時(shí)保持5-甲基胞嘧啶（5mC），PCR擴(kuò)增后測(cè)序，可以達(dá)到單堿基分辨率，將亞硫酸鹽處理與下一代測(cè)序（NGS）結(jié)合，產(chǎn)生5mC的WGBS數(shù)據(jù)，基因組覆蓋率超過(guò)70%。此外，血漿中的ctDNA濃度極低，制備WGBS文庫(kù)需要約2000ng基因組DNA，顯著超過(guò)臨床可用血漿樣品中的ctDNA水平。 本文的改進(jìn)版ctDNA-WGBS，可從微量ctDNA中準(zhǔn)確繪制全基因組甲基化圖譜，從200μL血漿中提取微量ctDNA，為防止樣本丟失和低ctDNA要求，將末端修復(fù)、dA加尾、接頭連接和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程在一個(gè)管中進(jìn)行。另外使用磁珠代替瓊脂糖凝膠捕獲，可以顯著提高回收率。該方法應(yīng)用于全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測(cè)早期癌癥患者的5mC，微量input（低至1ng）文庫(kù)制備、無(wú)偏倚的全基因組覆蓋和全面的計(jì)算方法，可以在多中心患者隊(duì)列中以高特異性和敏感性進(jìn)行早期乳腺癌（BC）檢測(cè)，降低了低復(fù)發(fā)片段和非腫瘤來(lái)源ctDNA的音噪。另外，ctDNA-WGBS還可以通過(guò)DNA甲基化模式上的細(xì)微差異來(lái)區(qū)分癌癥的分子分型。
圖1： ctDNA 5mC測(cè)序數(shù)據(jù)生成和分析工作流程圖。
材料方法：
患者隊(duì)列 訓(xùn)練集：招募38名早期/非轉(zhuǎn)移性女性BC患者（平均年齡±標(biāo)準(zhǔn)差[SD]:50.87±11.05）。 第一個(gè)重復(fù)隊(duì)列（測(cè)試集1）：招募15名早期/非轉(zhuǎn)移性女性BC患者（平均年齡±SD:53.47±8.88）。 第二個(gè)重復(fù)隊(duì)列（測(cè)試集2）：招募70名晚期/轉(zhuǎn)移性女性BC患者（平均年齡±SD:50.7±10.31）。 共123名女性BC患者。 40名年齡匹配的健康女性納入2個(gè)健康對(duì)照組，對(duì)照組1為n=25，對(duì)照組2為n=15 ctDNA-WGBS樣本提取、建庫(kù)測(cè)序、生信分析 從血液中提取的 DNA 儲(chǔ)存，血液離心分離獲得血漿，從約4-5 mL 血漿中平均可獲得 20-80ng ctDNA，樣品在使用前保持在-80°C。 結(jié)果
圖2：Max-cap提取的高質(zhì)量ctDNA和Mini-lib全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）制備的文庫(kù)。
C-E. LabChip GX touch對(duì)30 ng ctDNA input進(jìn)行文庫(kù)制備。 F. LabChip GX touch對(duì)1 ng ctDNA input的文庫(kù)進(jìn)行分析。 G. 與其他文庫(kù)制備方法相比，只有Mini-lib可以為WGBS提供1 ng input ctDNA文庫(kù)制備，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。 （2）深度學(xué)習(xí)算法揭示癌癥特異性復(fù)發(fā)區(qū)域
圖3：循環(huán)區(qū)域的計(jì)算工作流分析。
B和C. RRBS和WGBS分別在全基因組范圍內(nèi)識(shí)別的重復(fù)區(qū)域條形圖 （3）高基因組覆蓋率ctDNA甲基化組可實(shí)現(xiàn)腫瘤的靈敏檢測(cè)
圖4： 乳腺癌早篩：ctDNA差異甲基化區(qū)域（DMR）早期檢測(cè)乳腺癌。
（4）ctDNA甲基化可以區(qū)分不同的癌癥類型和亞型
圖5： ctDNA甲基化可以作為乳腺癌亞型分類和預(yù)測(cè)ER狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物。
關(guān)于易基因微量cfDNA基因組甲基化測(cè)序(cfDNA-BS） cfDNA片段化嚴(yán)重，片段大小常在150bp左右，現(xiàn)有甲基化檢測(cè)技術(shù)包括cfMeDIP和微量WGBS等。無(wú)法做到堿基分辨、具有抗體特異性和非特異性捕獲、覆蓋深度低、檢測(cè)成本高等特點(diǎn)。常規(guī)RRBS富集約70-350bp范圍酶切片段，如對(duì)于CG含量高的片段將被切割的更碎而無(wú)法檢測(cè)，保留下來(lái)的片段反而是CG含量低，無(wú)甲基化信息的基因片段。 易基因研發(fā)cfDNA-RBS技術(shù)，特異性捕獲CCGG位點(diǎn)兩端的DNA，通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序，實(shí)現(xiàn)高深度，單堿基分辨檢測(cè)CG位點(diǎn)甲基化信息。DNA起始量?jī)H需5ng，是目前腫瘤甲基化標(biāo)志物檢測(cè)研究的優(yōu)選技術(shù)，應(yīng)用場(chǎng)景包括腫瘤早篩、腫瘤診斷、個(gè)性化用藥、實(shí)時(shí)監(jiān)控、預(yù)后監(jiān)測(cè)等。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
應(yīng)用場(chǎng)景：
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請(qǐng)致電易基因。
參考文獻(xiàn)： Gao Y, et al. Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e1014. doi: 10.1002/ctm2.1014. PubMed PMID: 35998020. 相關(guān)閱讀： 技術(shù)推介 | 微量cfDNA簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序(cfDNA-RBS） 3文一覽：基于cfDNA甲基化的液體活檢在胰腺疾病中的研究進(jìn)展 前沿技術(shù)：cfDNA甲基化分析揭示造血細(xì)胞移植的所有主要并發(fā)癥 |
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來(lái)自： 深圳易基因科技 > 《高分文獻(xiàn)》
