在癌癥領(lǐng)域研究中，鐵死亡是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡形式，使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感的信號(hào)通路和因素未探究清楚。觸發(fā)鐵死亡可以有效地治療對(duì)促凋亡和其他常規(guī)抗腫瘤治療耐藥的腫瘤細(xì)胞。因此，全面研究信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和引起鐵死亡的相關(guān)因素對(duì)于制定有效策略使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感并開(kāi)發(fā)有效的基于鐵死亡治療至關(guān)重要。凌恩生物客戶(hù)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第十人民醫(yī)院近期在《Clinical and Translational Medicine》期刊(IF=10.892)發(fā)表“Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming”研究論文，確定了RB1CC1是腫瘤細(xì)胞中感知鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并提出了一種新的鐵死亡相關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路的新思路。
期刊：Clinical and Translational Medicine 影響因子：10.892 發(fā)表時(shí)間：2022 樣本類(lèi)型：腫瘤細(xì)胞 客戶(hù)單位：同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第十人民醫(yī)院 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)測(cè)量細(xì)胞死亡和脂質(zhì)活性氧（ROS）的產(chǎn)生來(lái)確定細(xì)胞中的鐵死亡水平。通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq和蛋白質(zhì)組檢測(cè)，確定目標(biāo)分子RB1CC1。后續(xù)通過(guò)免疫印跡和免疫組織化學(xué)分析RB1CC1和相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過(guò)ChIP-seq檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡和RB1CC1的轉(zhuǎn)錄程序。最后，構(gòu)建了肝癌小鼠模型，來(lái)評(píng)估JNK激動(dòng)劑對(duì)一種鐵死亡誘導(dǎo)劑(IKE)治療的影響， 圖 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1、RB1CC1使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感 為了篩選潛在的脂質(zhì)ROS調(diào)節(jié)和鐵死亡相關(guān)因子，作者對(duì)erastin（脂質(zhì)ROS和鐵死亡誘導(dǎo)劑）和Fer-1（脂質(zhì)ROS和鐵死亡抑制劑）處理的肝細(xì)胞癌（HCC）HepG2細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)果獲得了六個(gè)候選分子，其中沉默RB1CC1產(chǎn)生了最顯著的效果（圖1），即對(duì)鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡變得不敏感。作者繼續(xù)評(píng)估了用RSL3（鐵死亡誘導(dǎo)劑）和erastin處理的一系列癌細(xì)胞系中RB1CC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HepG2、結(jié)腸癌HCT29等多種癌細(xì)胞中RB1CC1以時(shí)間依賴(lài)性方式上調(diào)（圖1C-D）。在用RSL3和erastin處理的HepG2細(xì)胞中，自噬體形成的沒(méi)有顯著增強(qiáng)（圖1E）。結(jié)果表明，RB1CC1通過(guò)不依賴(lài)自噬的方式對(duì)鐵死亡敏感。為了探索 RB1CC1 在體內(nèi)的作用，作者在預(yù)給藥IKE 2天后，通過(guò)剖宮產(chǎn)獲得RB1CC1純合缺失的小鼠胎兒，發(fā)現(xiàn)IKE介導(dǎo)的胎兒的丙二醛和4-HNE不如WT組強(qiáng)（圖 1G-I），證明了鐵死亡相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化是RB1C1依賴(lài)性的。此外，RB1CC1敲除組的IKE并不像對(duì)照組那樣抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化（圖 1J-L）。 圖1 RB1CC1使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感 2、核易位的RB1CC1作為鐵死亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子 為了探究RB1CC1 如何參與鐵死亡的信號(hào)調(diào)節(jié)，通過(guò)RB1CC1的KO（敲除）或過(guò)表達(dá)（OV）減輕或增強(qiáng)RB1 mRNA表達(dá)（圖2A），這表明RB1CC1可能作為轉(zhuǎn)錄因子，在觸發(fā)鐵死亡時(shí)增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。隨后通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) RB1CC1 被募集到用RSL3和erastin處理細(xì)胞中的 RB1 啟動(dòng)子中的 RB1CC1 結(jié)合區(qū) (RBR)（圖 2B）。RB1CC1在觸發(fā)鐵死亡后1小時(shí)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并在HepG2細(xì)胞中在處理后4小時(shí)變得明顯（圖2C）。HepG2細(xì)胞的細(xì)胞分級(jí)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了RB1CC1的鐵死亡誘導(dǎo)的核易位（圖2D）。通過(guò)磷酸化蛋白凝膠檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RB1CC1中的499-548位氨基酸區(qū)域?qū)τ阼F死亡誘導(dǎo)的RB1CC1核易位至關(guān)重要（圖 2E），S537A突變能消除了RSL3和erastin治療后RB1CC1的超移（圖 2F-H），細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞死亡檢測(cè)也均表明RB1CC1在S537殘基處以鐵死亡依賴(lài)的方式被磷酸化（圖 2I-J）。以上證明RB1CC1的鐵死亡誘導(dǎo)的核易位與S537殘基的磷酸化有關(guān)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的鐵死亡敏感至關(guān)重要。 圖2 RB1CC1的核易位使細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感
3、RB1CC1涉及H4K12Ac組蛋白修飾在刺激增強(qiáng)子依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄中的新作用 為了探索鐵死亡觸發(fā)后其轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)制，作者進(jìn)行了免疫沉淀（IP）和蛋白質(zhì)組學(xué)。組蛋白H4被鑒定為RSL3-和erastin誘導(dǎo)的RB1C1相關(guān)蛋白質(zhì)。組蛋白乙酰化與轉(zhuǎn)錄重編程密切相關(guān)。作者評(píng)估了RB1啟動(dòng)子內(nèi)RBR周?chē)膬煞N主要組蛋白H4修飾H4K12Ac和H4K16Ac，發(fā)現(xiàn)H4K12Ac水平以鐵死亡和RB1C1依賴(lài)的方式升高（圖3B），而H4K16Ac水平?jīng)]有變化。這些結(jié)果表明，RB1CC1可能通過(guò)增加H4K12C組蛋白修飾水平參與鐵死亡。在HepG2細(xì)胞中使用抗rb1cc1和抗h4k12ac抗體進(jìn)行ChIP-Seq來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡和RB1CC1依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄程序，發(fā)現(xiàn)與RSL3和erastin有關(guān)的RB1CC1占據(jù)了5個(gè)新的峰，并伴隨著H4K12Ac組蛋白修飾的顯著增加（圖 3C-E）。通過(guò)基序分析和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，表明鐵死亡誘導(dǎo)的增強(qiáng)子活性可能依賴(lài)于RB1CC1與FOX基序的相互作用（圖 3F-G）。根據(jù)RNA-seq結(jié)果，RSL3處理后SEC3、CYTH3、MEPCE、CYREN、CHCHD3、TPD52、SLC25A32、MYC和VRK3表達(dá)上調(diào)，是潛在的鐵死亡相關(guān)基因（圖 3H）。通過(guò)3C實(shí)驗(yàn)確定了RB1cc1相關(guān)增強(qiáng)子和鐵死亡相關(guān)基因啟動(dòng)子之間的相互作用（圖 3I-J）。這些結(jié)果揭示了增強(qiáng)子結(jié)合對(duì)于RB1CC1刺激鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)至關(guān)重要。 圖3 RB1CC1與H4K12Ac連接，介導(dǎo)鐵死亡相關(guān)和增強(qiáng)子依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄
4、RB1CC1 通過(guò)其靶基因調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體和鐵死亡 GO富集發(fā)現(xiàn)九個(gè)鐵死亡相關(guān)基因中的三個(gè)（圖3H）被預(yù)測(cè)與線(xiàn)粒體相關(guān)，其中兩個(gè)被預(yù)測(cè)參與線(xiàn)粒體內(nèi)膜組織（圖4A）。這表明RB1CC1可能通過(guò)其靶基因CHCHD3以線(xiàn)粒體依賴(lài)的方式使細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感（圖 4A-C）。在缺乏線(xiàn)粒體DNA的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)CHCHD3，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體至少是RB1CC1和CHCHD3對(duì)鐵死亡敏感的關(guān)鍵（圖 4D-F）。根據(jù)MMP和細(xì)胞死亡檢測(cè)，RSL3和erastin處理后，CHCHD3敲除使RB1CC1對(duì)MMP的刺激無(wú)效（圖 4G-J）。小鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，IKE誘導(dǎo)的Chchd3表達(dá)是Rb1cc1依賴(lài)的，同時(shí)，Rb1cc1對(duì)于RSL3和erastin誘導(dǎo)的Chchd3的上調(diào)是不可或缺的（圖 4K-M）。因此，CHCHD3作為RB1CC1的下游效應(yīng)分子，決定了線(xiàn)粒體功能和鐵死亡。 圖4 RB1CC1靶基因與線(xiàn)粒體相關(guān)
5、ELP3與RB1C1相互作用以調(diào)節(jié)H4K12C組蛋白修飾和鐵死亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序 通過(guò)蛋白組學(xué)檢測(cè)尋找RB1C1相關(guān)的組蛋白調(diào)節(jié)因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了48種RSL3誘導(dǎo)的H4相關(guān)蛋白和143種erastin誘導(dǎo)的H3相關(guān)蛋白（圖 5A）。ChIP和Re-ChIP實(shí)驗(yàn)表明，RSL3和erastin處理后，兩種與線(xiàn)粒體相關(guān)RB1CC1靶基因CHCHD3和SLC25A32通過(guò)ELP3誘導(dǎo)表達(dá)（圖 5B-E）。通過(guò)3C實(shí)驗(yàn)和ChIP檢測(cè)，在ELP3敲除細(xì)胞中，ELP3對(duì)于SLC25A32和CHCHD3這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的關(guān)聯(lián)是不可或缺的（圖 5F-G）。這表明ELP3對(duì)RB1CC1刺激鐵死亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄重編程至關(guān)重要。細(xì)胞共定位和細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RB1CC1和ELP3依賴(lài)C端相互作用，對(duì)于使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感至關(guān)重要（圖 5H-J）。
圖5 ELP3對(duì)于RB1CC1介導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄重編程至關(guān)重要 6、激活JNK刺激RB1CC1使鐵死亡敏感并抑制腫瘤發(fā)生 使用FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)（Sel-leckchem）處理對(duì)鐵死亡的敏感性低的A549細(xì)胞，確定了PTX、Cllolar、OXA和TMZ這四種可協(xié)同誘導(dǎo)RB1CC1核易位的藥物（圖 6A-D）。這四種藥物均可磷酸化和激活JNK，使用JNK抑制劑可阻止JNK和RB1CC1的磷酸化，而RB1CC1的磷酸化對(duì)其核易位至關(guān)重要（圖 6E-G）。這表明JNK激活物傾向于增強(qiáng)RB1CC1的磷酸化及其核易位。此外，結(jié)果表明JNK抑制劑可減輕RSL3和erastin誘導(dǎo)的MMP、mitoROS的生成和細(xì)胞死亡（圖 6J）。IKE與PTX、Cllolar、OXA和TMZ共同給藥可抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤生長(zhǎng)（圖 6K）。 圖6 激活JNK加強(qiáng)了RB1CC1對(duì)鐵死亡的敏感性作用
7、本研究的臨床和轉(zhuǎn)化意義 研究還表明RB1CC1在肺癌隊(duì)列中也表達(dá)上調(diào)（圖 7A-B）。根據(jù)RB1CC1的細(xì)胞定位，將肺癌樣本分為細(xì)胞質(zhì)亞型、核亞型和質(zhì)/核亞型，免疫組化分析顯示細(xì)胞核亞型的4-HNE水平最高（圖 7C-E）。大部分檢測(cè)的肺癌樣本為RB1CC1核定位，核定位的原代LUSC細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性也較高（圖 7F-G）。作者發(fā)現(xiàn)DEN/ccl4在WT和RB1CC1+/-小鼠肝癌模型中誘導(dǎo)肝腫瘤發(fā)生的能力相似（圖 7H-I）。在RB1CC1+/-小鼠中，IKE對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用顯著降低，生存結(jié)果也受到了影響（圖 7J-K）。總之，RB1CC1對(duì)于基于鐵死亡的抗腫瘤治療的療效至關(guān)重要。 圖7 本研究的臨床和轉(zhuǎn)化意義
本研究確定了RB1CC1是腫瘤細(xì)胞中感知鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并提出了一種新的鐵死亡相關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路。同時(shí)，以RB1CC1為靶點(diǎn)是加強(qiáng)基于鐵死亡的腫瘤治療的一個(gè)有希望的前景。 參考文獻(xiàn) Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming. Clinical and Translational Medicine, 2022.
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