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編譯：微科盟R.A，編輯：微科盟居居、江舜堯。
微科盟原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載，轉(zhuǎn)載須注明來源《微生態(tài)》公眾號。 導(dǎo)讀腸道是控制人體健康的基礎(chǔ)。腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞持續(xù)接觸數(shù)以百萬計(jì)的微生物，這些微生物對腸上皮屏障和免疫功能有很大的影響。腸道菌群現(xiàn)在被認(rèn)為是人類的重要伙伴，積極促進(jìn)腸道和遠(yuǎn)端器官的基本功能。在腸道生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群與宿主之間的雙向通訊不涉及直接的細(xì)胞接觸。微生物和宿主來源的胞外囊泡(EVs)是這種跨界相互作用的關(guān)鍵參與者。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)菌分泌的囊泡通過向宿主細(xì)胞運(yùn)輸和傳遞調(diào)節(jié)宿主信號通路和細(xì)胞過程的效應(yīng)分子來介導(dǎo)菌群功能。因此，腸道微生物群釋放的囊泡可能對健康和疾病有很大的影響。本文回顧了當(dāng)前關(guān)于腸道微生物群EVs的知識，并特別強(qiáng)調(diào)了它們在控制宿主代謝、腸道屏障完整性和免疫訓(xùn)練中的作用。 原名：Microbiota-derived
extracellular vesicles in inter kingdom communication in the gut 譯名：微生物來源的胞外囊泡在腸道內(nèi)界間通訊中的作用
期刊：Journal
of Extracellular Vesicles
IF：17.337
發(fā)表時(shí)間：2021.11
通訊作者：Laura
Baldomà
通訊作者單位：西班牙巴塞羅那大學(xué)
DOI號：10.1002/jev2.12161
1 引言 2 細(xì)菌胞外囊泡(BEVs) 3 BEVs與哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的相互作用 4 腸道菌群對腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的貢獻(xiàn) 5 BEVs在腸道上皮中的轉(zhuǎn)運(yùn) 6 總結(jié) 人體的皮膚和粘膜表面定居著大量的微生物，統(tǒng)稱為微生物組。在腸道中，定殖特別重要，就結(jié)腸中的微生物種群數(shù)量來說，每克糞便(濕重)中的微生物數(shù)量超過1011個(gè)。腸道微生物，稱為腸道微生物群落，主要由細(xì)菌組成，但也包括古菌、真菌和病毒?？傮w而言，腸道微生物群貢獻(xiàn)了超過300萬個(gè)基因，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過并補(bǔ)充了人類基因組編碼的遺傳信息。事實(shí)上，因微生物群編碼的產(chǎn)物積極地對宿主許多基本的功能發(fā)揮作用，腸道微生物群被認(rèn)為是一個(gè)“隱形的器官”。除了在營養(yǎng)、代謝和能量生產(chǎn)中的作用，對病原體和其他損傷引起的炎癥反應(yīng)中，腸道微生物群還具有調(diào)節(jié)免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。腸道微生物群在胃腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育中的關(guān)鍵作用已在無菌小鼠模型中得到證實(shí)。當(dāng)腸道微生物群失調(diào)時(shí)，無菌動(dòng)物表現(xiàn)出免疫功能受損，并伴有萎縮淋巴器官和免疫球蛋白A(IgA)減少，而這時(shí)宿主更容易發(fā)生感染和過敏反應(yīng)等病癥。腸道微生物群與宿主腸粘膜細(xì)胞建立了復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的、雙向的聯(lián)系。由于腸道屏障的結(jié)構(gòu)，它們之間的相互作用不涉及直接的細(xì)胞接觸。腸上皮粘液層產(chǎn)生了一種物理隔離，阻止腔內(nèi)細(xì)菌進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞。在結(jié)腸中，分泌的粘液、凝膠形成的粘蛋白2形成一個(gè)明確界定的分層，分成兩個(gè)層。內(nèi)層高度致密，物理上隔離腔內(nèi)細(xì)菌。此外，內(nèi)粘液層含有由上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌的抗菌肽和免疫效應(yīng)物，它們的靶標(biāo)是腸腔細(xì)菌。這有助于宿主-細(xì)菌的空間隔離。外層粘液層是松散的，提供了大量細(xì)菌在腸道內(nèi)的粘附和定植部位。這一外層被腸道微生物群中的特定細(xì)菌降解。因此，它需要不斷更新以保持完整和健康的內(nèi)粘液層。作為對共生或機(jī)械降解的反應(yīng)，杯狀細(xì)胞產(chǎn)生粘蛋白2的過程可通過toll樣受體(TLR)信號通路上調(diào)。由于微生物進(jìn)入腸道上皮的途徑因物理和化學(xué)隔離受到限制，與宿主的通訊主要依賴于微生物分泌物，如代謝物、蛋白質(zhì)和胞外囊泡(EVs)，這些因子可以通過粘蛋白層到達(dá)腸道黏膜表面的宿主細(xì)胞。本文就微生物分泌的EVs及其在腸道中作為細(xì)菌-宿主相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)的作用進(jìn)行綜述。在接下來的章節(jié)中，我們將討論它們作為調(diào)節(jié)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和人體健康的重要功能的信號所發(fā)揮的作用。1967年在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌產(chǎn)生EVs。對數(shù)生長細(xì)菌細(xì)胞的電子顯微鏡分析顯示，擠壓細(xì)菌外膜產(chǎn)生球形膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的釋放。這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生被視為是一種毒素分泌機(jī)制。最初，這些囊泡狀顆粒被認(rèn)為是不必要的結(jié)構(gòu)。然而，隨著研究的深入，這些囊泡作為細(xì)菌細(xì)胞生理和通訊的一種活躍的、調(diào)節(jié)的基本機(jī)制得到了認(rèn)可。由于它們的起源，這些小泡被命名為膜囊泡。近幾十年來，人們對其生物發(fā)生機(jī)制、組成和功能進(jìn)行了深入的研究。眾所周知，所有的細(xì)菌都會(huì)釋放EVs作為物種間交流的一種機(jī)制。細(xì)菌胞外囊泡(BEVs)由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，是細(xì)菌分子的天然載體。BEVs的組成和含量來源于生產(chǎn)菌株，并因生長階段和條件的不同而有所不同。目前，科學(xué)家們假設(shè)：囊泡的載體決定了它們的功能。對大量細(xì)菌進(jìn)行的研究表明，革蘭氏陰性菌產(chǎn)生不同種類的細(xì)菌胞外囊泡。主要類型來自外膜，被稱為“外膜囊泡”(OMVs)。OMVs是由外膜囊的外單層和磷脂內(nèi)單層組成的球形顆粒。它們起源于外膜起泡，因此富集在外膜和周質(zhì)生物分子中。此外，在革蘭氏陰性細(xì)菌中觀察到被稱為“外-內(nèi)膜囊泡” (O-IMVs)的囊泡。這些囊泡會(huì)同時(shí)作為外膜和細(xì)胞膜而發(fā)揮作用。除了周質(zhì)組分，它們還包括內(nèi)膜蛋白和胞質(zhì)分子。假設(shè)大多數(shù)革蘭氏陰性菌同時(shí)產(chǎn)生兩種囊泡，即OMVs和O-IMVs。最近的研究描述了一種新型的革蘭氏陰性細(xì)菌來源的囊泡，稱為“破裂性外膜囊泡”(E-OMVs)。這個(gè)基于噬菌體編碼的內(nèi)溶素誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的模型，可以解釋為什么OMVs也含有DNA和胞漿蛋白。與革蘭氏陰性細(xì)菌不同，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁由一層厚而堅(jiān)硬的肽聚糖外層組成，這層肽聚糖最初被認(rèn)為可以阻止細(xì)菌胞外膜囊泡的釋放。多年來，革蘭氏陽性菌BEVs的研究一直被忽視。這個(gè)領(lǐng)域在過去十年里才得到更多的關(guān)注。多種革蘭氏陽性物種，如：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的研究證實(shí)，革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的BEVs也是直徑為20-100納米的球形膜顆粒。由于缺乏外膜，革蘭氏陽性菌的(EVs)被命名為“細(xì)胞質(zhì)膜囊泡”。來自革蘭氏陽性細(xì)菌的BEVs缺乏外膜囊和周質(zhì)組分，但攜帶類似于革蘭氏陰性細(xì)菌EVs的載體分子，包括肽聚糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸。為了簡化命名，我們將在下文用術(shù)語BEVs來指代所有類型的細(xì)菌來源的囊泡，除非特別強(qiáng)調(diào)適用于特定細(xì)菌胞外囊泡的子類囊泡(例如：OMVs或CMVs)。2.2 細(xì)菌胞外囊泡的生物發(fā)生過程盡管BEVs具有重要的生物學(xué)意義，但我們對其生物發(fā)生的機(jī)制仍然知之甚少。根據(jù)最新的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們已經(jīng)提出了BEVs生物發(fā)生的一些模型。對于革蘭氏陰性細(xì)菌，最初的研究表明，BEVs是在自然條件下產(chǎn)生的并且是與細(xì)菌細(xì)胞壁更新有關(guān)的副產(chǎn)物。在細(xì)胞壁回收過程中，失去外膜和肽聚糖之間的相互作用導(dǎo)致外膜出芽和隨后釋放OMVs。BEVs在應(yīng)力條件下也會(huì)脫落。一種模型是基于由于肽聚糖片段或周質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的積累而引起的物理應(yīng)力，這種應(yīng)力導(dǎo)致膨脹壓力的增加，從而導(dǎo)致外膜膨出。這個(gè)模型支持了這樣的觀點(diǎn)，即：OMVs的形成可能是一種有益的廢棄機(jī)制，以去除過量的有害蛋白質(zhì)。此外，抗生素環(huán)丙沙星引起的Stenotrophomonas maltophilia應(yīng)激促進(jìn)了其他物種的BEVs，包括OMVs和O-IMVs釋放的增加。第三個(gè)模型涉及LPS對外部因素的結(jié)構(gòu)性變化。高電負(fù)性的LPS的陽離子濃度的變化可能導(dǎo)致局部負(fù)電荷的積累和LPS分子之間的排斥，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的局部變形和囊泡脫落。將假單胞菌喹諾酮信號(PQS)插入外膜的外小葉可通過這種機(jī)制增加膜曲率和OMVs的形成。其他影響LPS重構(gòu)的其他因素也會(huì)導(dǎo)致外膜曲率和OMVs形成的改變。LPS通過一種稱為脂質(zhì)A的酰基化雙糖固定在外膜的外小葉上。在腸道沙門氏菌血清型胸腺瘤中，脂質(zhì)A的去?；瘜?dǎo)致高囊泡化和OMV的產(chǎn)生。相比之下，pagL突變體在催化脂質(zhì)A去酰化的酶中有缺陷，與野生型菌株相比OMVs釋放量顯著減少。最近的研究表明，所有生長條件下磷脂在外膜的內(nèi)部和外部小葉之間的不對稱分布是OMVs形成的一般機(jī)制。事實(shí)上，突變的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VacJ/Yrb顯示高產(chǎn)囊泡的表型。這是由于磷脂在外膜的外層單張中積累，引發(fā)了不對稱膨脹、膜膨脹和隨后的OMVs釋放。這個(gè)涉及VacJ/YrbABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的機(jī)制由革蘭氏陰性細(xì)菌中鐵的可利用性來調(diào)節(jié)。在這個(gè)模型中，細(xì)胞裂解由噬菌體編碼的內(nèi)溶素所觸發(fā)，內(nèi)溶素降解肽聚糖細(xì)胞壁。一旦肽聚糖被降解，細(xì)胞聚集并破裂。破碎的薄膜碎片聚集起來并組裝成E-OMVs。革蘭氏陽性細(xì)菌BEVs的生物發(fā)生起源尚不清楚。早期的研究表明，囊泡可能是通過孔隙在細(xì)胞壁的膨脹壓力，從細(xì)胞膜出芽而生成。然而，目前的模型涉及到肽聚糖降解酶的機(jī)制，類似于銅綠假單胞菌所描述的破裂性細(xì)胞裂解。這一機(jī)制在用絲裂霉素C處理枯草桿菌這一實(shí)驗(yàn)中可得到證實(shí)。這種抗生素藥物引起基因毒性應(yīng)激，導(dǎo)致激活由整合在細(xì)菌染色體上的前噬菌體編碼的內(nèi)溶素。隨后肽聚糖的降解導(dǎo)致細(xì)胞通過肽聚糖層的孔突出細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，使CMVs釋放。銅綠假單胞菌細(xì)胞聚集破裂，而枯草芽孢桿菌來源的CMVs通過細(xì)胞壁上形成的孔隙釋放。此外，最近一項(xiàng)對金黃色葡萄球菌的研究表明，這種細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，如苯酚可溶性調(diào)節(jié)素和自溶素，可增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，促進(jìn)CMVs的形成。同樣，抗生素在金黃色葡萄球菌中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過獨(dú)立于噬菌體的方式增加肽聚糖層的滲透性而觸發(fā)CMVs的產(chǎn)生。除了酶控制革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生巨細(xì)胞病毒外，科學(xué)家們還研究了囊胚形成的遺傳調(diào)控機(jī)制。單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因編碼因子σB(sigB)或產(chǎn)膿鏈球菌的雙組分系統(tǒng)CovRS的中斷導(dǎo)致巨細(xì)胞病毒的產(chǎn)生改變，從而引發(fā)囊泡生物發(fā)生中的調(diào)控。BEVs一旦被釋放就會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的通信，其效果取決于它們的載體。BEVs的物質(zhì)組成受所生產(chǎn)的菌種類型、生長和環(huán)境條件以及生物發(fā)生機(jī)制的影響。載體分子的多樣性賦予BEVs在細(xì)菌-細(xì)菌和細(xì)菌-宿主相互作用中的關(guān)鍵作用。許多研究表明，某些蛋白質(zhì)和脂質(zhì)被選擇性地整合到BEVs中。然而，這些分子是如何被挑選出來的仍然是個(gè)未知數(shù)。在這種背景下，預(yù)先形成的外膜微區(qū)的機(jī)制可以用來解釋BEVs中某些蛋白質(zhì)的富集差異。在本節(jié)中，我們從蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和小分子方面概述了關(guān)于BEVs組成的一般信息。BEVs的蛋白質(zhì)含量并不完全相同，取決于親代細(xì)菌?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)方法的研究已經(jīng)確定了與許多生物過程相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)根據(jù)它們的功能分為六類：結(jié)構(gòu)蛋白、孔蛋白、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶和與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。從這些研究中，我們了解到革蘭氏陰性菌釋放的BEVs富含外膜蛋白，如OmpA、OmpC和OmpF，以及周質(zhì)蛋白如AcrA和堿性磷酸酶。來自不同革蘭氏陰性病原體的BEVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了毒力因子以及大量參與生物膜形成、致病性和宿主-細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)的存在。在Salmonella enterica serovar
thyphymurium中也發(fā)現(xiàn)了參與囊泡生物發(fā)生或調(diào)控囊泡大小、產(chǎn)量和載體的蛋白質(zhì)。對革蘭氏陰性益生菌和共生菌釋放的囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，囊泡中含有促進(jìn)菌株在腸道定植、競爭和細(xì)菌存活以及調(diào)節(jié)宿主免疫和防御反應(yīng)的蛋白質(zhì)。一些鑒定出的蛋白質(zhì)是菌株特異性的。有趣的是，益生菌Escherichia coli Nissle 1917(EcN)釋放的BEV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了一組由革蘭氏陰性病原體分泌的BEV共有的蛋白質(zhì)。這些是兼職蛋白質(zhì)，根據(jù)細(xì)胞位置發(fā)揮不同的功能。此外，該研究還揭示了由菌株特異性基因編碼的蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)是有助于細(xì)菌在有害的腸道環(huán)境中生長和存活的粘附素和適應(yīng)因子。對于革蘭氏陽性細(xì)菌的BEVs，不同種類細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、炭疽桿菌等)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了與多種生物學(xué)過程相關(guān)的膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。最近的研究表明，從幾種革蘭氏陽性益生菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中分離出的CMVs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在免疫調(diào)節(jié)和宿主相互作用中起到有益作用。脂質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)組成部分，來自革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的相應(yīng)BEVs分別是OMVs和CMVs。一直以來，外膜磷脂都存在于OMVs中。然而，有證據(jù)表明OMVs包含一些在細(xì)菌外膜中沒有發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)。在大腸桿菌中的研究表明，OMVs包括參與膜折疊的脂質(zhì)，如甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂。脂肪酸結(jié)構(gòu)影響脂膜的流動(dòng)性和剛性。在銅綠假單胞菌中，飽和脂肪酸的相對含量比細(xì)胞外膜高1.5倍左右，這一事實(shí)與細(xì)胞膜剛度有關(guān)。相反，在革蘭氏陽性A組鏈球菌菌株中存在飽和脂肪酸。LPS是細(xì)菌OMVs的一般組成部分，盡管囊泡和細(xì)菌外膜之間的LPS組成可能存在差異。在這種情況下，有報(bào)道稱與細(xì)胞壁相比，Porphyromonas gingivalis OMVs攜帶有長糖鏈和脫?；|(zhì)A的LPS分子。同樣，脫?；|(zhì)A在沙門氏菌OMVs中積累。在革蘭氏陽性細(xì)菌中，脂質(zhì)組學(xué)研究顯示CMVs和質(zhì)膜保留了一些重要方面，但在某些脂質(zhì)和脂蛋白上表現(xiàn)出一些差異。在炭疽桿菌和肺炎鏈球菌中，囊泡富含C12-C16鏈飽和脂肪酸。相反，在單核細(xì)胞增生李斯特菌衍生的囊泡中比在細(xì)菌細(xì)胞中含有更為豐富的不飽和脂肪的脂質(zhì)。此外，來自這種病原體的CMVs富含磷脂酰乙醇胺、鞘脂和三?；视?，但甘油三酯的代表性不足?？傮w而言，這些研究表明CMVs的脂質(zhì)組成可能因細(xì)菌種類而異。這些差異可能與某些生態(tài)位中的細(xì)菌適應(yīng)和生存有關(guān)。許多研究表明，革蘭氏陰性和革蘭氏陽性來源的BEVs載有核酸，包括DNA和RNA。因此，BEVs允許將DNA導(dǎo)入其他細(xì)菌細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)基因水平轉(zhuǎn)移。此外，BEVs促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸與宿主細(xì)胞內(nèi)特定受體的相互作用，從而觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在來自銅綠假單胞菌的BEVs中，大多數(shù)DNA攜帶與抗生素抗藥性、毒力和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的特定功能的基因。在革蘭氏陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌中，BEVs攜帶編碼細(xì)菌毒素的基因，如：α-毒素基因(plc)和產(chǎn)氣莢膜溶素O(pfoA)。變形鏈球菌BEVs的外源DNA主要與生物膜的形成和成熟有關(guān)。以上這些是細(xì)菌粘附過程中的基本過程。除了DNA，一些研究已經(jīng)表明在BEVs中存在RNA，這對于調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)和其他細(xì)胞過程具有重要意義。與BEVs相關(guān)的RNA受到保護(hù)而不被降解，從而促進(jìn)了其向真核靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。與BEVs相關(guān)的RNA編輯已經(jīng)發(fā)表。這些研究表明BEVs中的RNA富集在小的非編碼RNA中，這些RNA主要參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控。在某些情況下，RNA載體可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的表型改變。在某些病原菌中，通過BEVs分泌的小RNA介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)失調(diào)。此外，在大腸桿菌BEVs中發(fā)現(xiàn)的許多轉(zhuǎn)運(yùn)的小型非編碼RNA序列與與表觀遺傳機(jī)制(染色質(zhì)重構(gòu)，組蛋白修飾)或細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄控制相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的人類基因組區(qū)域?qū)R。有研究表明，BEVs相關(guān)的小RNA具有類似于真核miRNAs的調(diào)節(jié)作用。BEVs還載有調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能的代謝物和效應(yīng)分子。代謝組學(xué)研究表明，BEVs含有代謝物，這些代謝物根據(jù)生產(chǎn)菌株選擇性包裝。在多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)中，從致病或共生菌株中分離出的BEVs之間代謝物含量的變化與各菌株在腸道定殖和生存的能力相一致。BEVs包裝的其他效應(yīng)物也作為適應(yīng)因子，幫助細(xì)菌在特定的生態(tài)位中生存。例如，來自脆弱擬桿菌的BEVs載有抗菌肽BSAP，該肽對人類腸道中的其他擬桿菌目表現(xiàn)出抑制活性。BEVs還可作為載體分泌疏水性群體感應(yīng)分子，介導(dǎo)細(xì)菌群落中的通訊，控制如毒性或生物膜形成等重要過程。分泌BEVs是一個(gè)昂貴的過程，需要能量消耗。這種分泌機(jī)制是通過進(jìn)化選擇的，因?yàn)锽EVs具有重要作用，可以給予細(xì)菌自我保護(hù)或促進(jìn)與微生物群落或宿主的其他成員的相互作用和通訊。BEVs參與了許多生物過程，這可能根據(jù)它們的特定載體而有所不同。BEVs的功能可分為兩類：與細(xì)菌-細(xì)菌相互作用相關(guān)的功能和與細(xì)菌-宿主通訊相關(guān)的功能。關(guān)于細(xì)菌-細(xì)菌之間的相互作用，BEVs通過幫助、競爭或者殺死其他細(xì)菌，使生產(chǎn)細(xì)菌在生態(tài)位中生存下來。在這種情況下，BEVs可以作為一種微生物防御機(jī)制，提供保護(hù)功能，對抗包括噬菌體、抗生素、活性氧和抗菌肽在內(nèi)的有害物質(zhì)。釋放的BEVs可以隔離噬菌體，使他們不直接與細(xì)菌細(xì)胞相互作用，防止有害影響。BEVs也可作為針對細(xì)菌膜的污染物或抗生素的誘餌。除了作為抗生素靶標(biāo)的被動(dòng)作用外，BEVs還釋放賦予抗生素耐藥性的酶，這有利于微生物群落中的生產(chǎn)菌株和其他敏感細(xì)菌。在這種背景下，在金黃色葡萄球菌和擬桿菌的BEVs中發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶基因已在BEVs中發(fā)現(xiàn)。在這種情況下，BEVs允許物種內(nèi)和物種間水平轉(zhuǎn)移編碼抗生素耐藥性的基因。此外，BEVs還具有代謝優(yōu)勢。鐵載體、氨基酸或脂肪酸運(yùn)輸系統(tǒng)的存在促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)的獲取和細(xì)菌的存活，并可能作為一種對抗其他細(xì)菌的競爭機(jī)制。BEVs還可以攜帶水解酶，催化降解環(huán)境中存在的蛋白質(zhì)和復(fù)雜多糖。這可能有助于微生物群落獲取營養(yǎng)物質(zhì)。BEVs除了對細(xì)菌群落有益外，還可以發(fā)揮攻擊性功能。在這個(gè)意義上，它們攜帶降解酶，如胞壁質(zhì)水解酶、肽聚糖水解酶或內(nèi)肽酶來殺死競爭的細(xì)菌。來自某些粘球菌屬的BEVs已被證明含有具有抗菌活性的因子和大量引起目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞溶解的水解酶，因此給生產(chǎn)菌株賦予了捕食活性。在微生物群落中，BEVs在細(xì)胞間通訊中起著關(guān)鍵作用。如上所述，BEVs中分泌的疏水群體感應(yīng)分子可以根據(jù)種群密度協(xié)調(diào)細(xì)菌的生長和行為。群體感應(yīng)分子也驅(qū)動(dòng)微生物群落在生物膜中生長。有證據(jù)表明，BEVs是由多糖、脂類、核酸和蛋白質(zhì)組成的生物膜基質(zhì)的重要組成部分。生物膜的形成保護(hù)多種細(xì)菌群落，并有利于營養(yǎng)物質(zhì)的獲取和菌株的存活。在這種情況下，BEVs可以對這些功能做出貢獻(xiàn)。在細(xì)菌-宿主相互作用的背景下，BEVs很好地適應(yīng)了環(huán)境，并成為跨界通訊的必要條件。有證據(jù)表明，它們通過向靶細(xì)胞輸送細(xì)菌效應(yīng)物來控制宿主細(xì)胞的通路和過程。BEVs具有粘附素類分子，幫助其粘附于宿主細(xì)胞，而免疫受體識別的微生物分子參與激活炎癥反應(yīng)和防御反應(yīng)。在病原體中，BEVs攜帶毒力因子、毒素和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物，幫助細(xì)菌攻擊宿主細(xì)胞并破壞宿主機(jī)制，從而逃避免疫系統(tǒng)。對于與宿主建立共生關(guān)系的菌株，釋放的BEVs作為調(diào)節(jié)重要宿主功能的細(xì)菌介質(zhì)的傳遞機(jī)制。此外，基于其作為遠(yuǎn)程運(yùn)輸工具的特性以及其固有的多功能性和生物相容性，BEVs正被探索成為有前景的新型治療方法。目前，科學(xué)家們正在開發(fā)基因工程BEVs，作為新的疫苗和佐劑或?qū)ｉT的藥物輸送載體，用于治療新出現(xiàn)的和新的疾病。3 BEVs與哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的相互作用來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生的BEVs可以將其內(nèi)容物輸送到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞攝取BEVs主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)行。這一過程通過不同的途徑發(fā)生，取決于囊泡的表面和載體。吞噬作用是免疫系統(tǒng)吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)內(nèi)化BEVs的主要途徑。大多數(shù)關(guān)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞攝取BEVs機(jī)制的現(xiàn)有信息來自于針對革蘭氏陰性病原體的研究。首次對微生物群源性BEVs的研究集中在益生菌EcN和共生大腸桿菌菌株。研究表明，來自腸道大腸桿菌菌株的BEVs主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被幾個(gè)上皮細(xì)胞系內(nèi)化。內(nèi)化的BEVs始終與網(wǎng)格蛋白和核內(nèi)體和溶酶體的特異性標(biāo)志物共定位。特異性抑制劑對脂筏和小泡結(jié)構(gòu)域的破壞并不影響囊泡的攝取。此外，從一個(gè)大腸桿菌(EcN)tolR突變體中分離的BEVs的低溫透射電子顯微鏡分析證明，分離的囊泡中存在高度的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，存在與常見OMVs或O-IMVs不相符的異常結(jié)構(gòu)。該研究表明，tolR突變體的BEVs表現(xiàn)出細(xì)胞結(jié)合能力下降，從而對Caco-2細(xì)胞攝取水平產(chǎn)生負(fù)面影響。這表明只有傳統(tǒng)的(BEVs)可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地進(jìn)入上皮細(xì)胞。最近的一項(xiàng)研究揭示了從常駐腸道微生物B. thetaiotaomicron中攝取和運(yùn)輸BEVs的機(jī)制。作者通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，多形擬桿菌BEVs主要通過依賴于動(dòng)力蛋白的內(nèi)吞作用被腸上皮細(xì)胞(IECs)內(nèi)化，并被內(nèi)溶酶體囊泡分選。此外，體內(nèi)成像研究表明，一部分多形擬桿菌BEVs通過細(xì)胞旁遷移穿過腸上皮并到達(dá)全身循環(huán)。這表明BEVs介導(dǎo)與腸外組織的長距離通訊。關(guān)于革蘭氏陽性菌的BEVs的內(nèi)化途徑的研究很少。在益生菌Lactiplantibacillus plantarum BGAN8中，在存在內(nèi)吞途徑特異性抑制劑的情況下進(jìn)行的時(shí)間過程內(nèi)化實(shí)驗(yàn)證明，IECs中分泌囊泡的主要進(jìn)入途徑是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑，雖然其攝取動(dòng)力學(xué)比報(bào)道的革蘭氏陰性益生菌的BEVs慢。大腸桿菌BEVs在15-30分鐘的培養(yǎng)時(shí)有明顯的內(nèi)化，而檢測細(xì)胞內(nèi)的植物乳桿菌BEVs則需要1h以上。作者認(rèn)為，這種益生菌所分泌的豐富的胞外多糖物質(zhì)，伴隨著分離的BEVs，可以引起誘捕效應(yīng)，延緩BEVs與上皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相互作用，以實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞作用。其他內(nèi)部機(jī)制可能并行運(yùn)作，取決于囊泡的大小。捕獲BEVs的胞外多糖可為從該益生菌培養(yǎng)物中分離出來的BEVs形成大量的包膜，可被微胞吞作用吸收。BEVs含有親本菌株產(chǎn)生的生物成分。在這種情況下，介導(dǎo)與宿主細(xì)胞外蛋白或特定細(xì)胞受體粘附的表面載體分子是與靶細(xì)胞主要相互作用的決定因素，因此也會(huì)產(chǎn)生衍生效應(yīng)。BEVs還攜帶一組被稱為微生物相關(guān)分子模式(MAMPs)的分子，這些分子被宿主上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞表達(dá)的特異性受體識別。這些模式識別受體(PRRs)是先天免疫的關(guān)鍵組成部分，因?yàn)樗鼈兏兄c道微生物并介導(dǎo)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞根據(jù)其位置和與細(xì)胞膜的關(guān)聯(lián)表達(dá)不同類型的PRRs。TLRs是可位于質(zhì)膜(TLR2、TLR4、TLR5)或細(xì)胞內(nèi)體膜(TLR3、TLR7、TLR9)的跨膜蛋白，存在于BEVs表面的MAMPS(胞外多糖、脂多糖和脂蛋白)可以結(jié)合胞外TLRs激活參與免疫和防御反應(yīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號通路。此外，BEVs通過內(nèi)吞途徑被哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)化。通過這種機(jī)制，BEVs允許細(xì)胞內(nèi)傳遞其他封閉的MAMPs，如DNA或RNA，這些被內(nèi)吞區(qū)膜上的特定TLR受體識別。細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞溶素免疫受體(與細(xì)胞器膜無關(guān))，如核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域蛋白1(NOD1)和NOD2，它們被細(xì)菌肽聚糖片段激活。在非侵襲性革蘭氏陰性病原體中，內(nèi)化的BEVs是在宿主細(xì)胞內(nèi)傳遞肽聚糖和隨后激活NOD受體的一種機(jī)制。有關(guān)幽門螺桿菌的研究表明，NOD1與內(nèi)吞囊泡中的肽聚糖的相互作用發(fā)生在早期的核內(nèi)體，NOD1在BEVs的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過程中被募集。這些受體與肽聚糖結(jié)合后，通過激活核因子-kB(NF-kB)或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，最終上調(diào)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄(圖1)。這一機(jī)制也被微生物群大腸桿菌株釋放的BEVs激活。
圖1 宿主免疫受體對BEVs相關(guān)分子模式的識別。展示了位于宿主細(xì)胞膜(TLR1/6，TLR2，TLR4，TLR5)，位于核內(nèi)體膜(TLR3，TLR7/8，TLR9)和胞質(zhì)NODs(NOD1/NOD2)的toll樣受體(TLRs)，以及導(dǎo)致NF-kB激活的下游信號通路。不同信號傳導(dǎo)通路的蛋白質(zhì)被繪制成彩色橢圓。與每個(gè)受體特異性相互作用的分子相關(guān)模式用紅色表示。4 腸道菌群對腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的貢獻(xiàn)在過去20年中，許多研究集中在革蘭氏陰性病原體的BEVs上，因?yàn)樗鼈冏鳛閭鬟f毒性因子和分子的載體，抑制和逃避宿主的免疫反應(yīng)。益生菌和腸道微生物衍生囊泡的研究開始于2010年代。從那時(shí)起，大多數(shù)的研究都集中在革蘭氏陰性共生菌，特別是脆弱擬桿菌、多形擬桿菌、嗜粘蛋白艾克曼氏菌和益生菌大腸桿菌菌株EcN。革蘭氏陽性腸道微生物的BEVs研究起步較晚，主要集中在乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的益生菌。在本節(jié)中，我們回顧了BEVs作為腸道菌群影響腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要角色的現(xiàn)有研究。我們重點(diǎn)關(guān)注微生物BEVs如何控制食物代謝、腸上皮屏障完整性和免疫反應(yīng)。表1總結(jié)了本節(jié)提供的信息。 表1 評估微生物BEVs作為腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)過程調(diào)節(jié)劑作用的研究。
腸道微生物群在腸粘膜與宿主保持共生關(guān)系，并為健康個(gè)體提供重要的代謝、免疫和腸道保護(hù)功能。微生物群的一個(gè)重要功能是產(chǎn)生影響微生物和宿主的代謝物。腸道微生物中最豐富的一個(gè)門是擬桿菌門，它利用多種生物化學(xué)機(jī)制在腸道惡劣環(huán)境中定植。這些共生細(xì)菌在糖代謝和短鏈脂肪酸生產(chǎn)中的作用得到了充分研究，這些短鏈脂肪酸為宿主提供日常所需的能量。特別是，多形擬桿菌是研究共生細(xì)菌與宿主相互作用的一個(gè)很好的模型，因?yàn)樗趶?fù)雜的糖代謝中有明確的作用，且已獲得它的完整基因組。多形擬桿菌編碼幾種粘蛋白降解酶，如糖基水解酶和硫酸酯酶，這些酶可以同化粘蛋白聚糖和膳食營養(yǎng)物質(zhì)，因此比其他細(xì)菌具有適應(yīng)性優(yōu)勢。一些分解產(chǎn)物可以被腸道微生物群的其他成分用作營養(yǎng)來源。這有利于建立一個(gè)平衡的微生物共生群落。重要的是，細(xì)菌對復(fù)雜碳水化合物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生了SCFAs池，這些SCFAs通過大腸被重新吸收，并被宿主用作能量來源，提供了大量的日常能量需求。擬桿菌產(chǎn)生的BEVs是這種酶活性的來源，對宿主代謝有很大的影響。大多數(shù)研究都是針對多形擬桿菌和脆弱擬桿菌進(jìn)行的。脆弱擬桿菌是一種良好的腸道定植菌。事實(shí)上，它通常是從健康的人類糞便中分離出來的。來源于多形擬桿菌的BEVs含有幫助腸道多糖消化的酶。蔬菜中存在的磷酸肌醇(InsP6)通過螯合二價(jià)陽離子干擾多糖消化。由于人類IECs不表達(dá)能使InsP6去磷酸化的酶，該活性依賴于腸道菌群編碼的酶。此外，在擬桿菌來源的BEVs中發(fā)現(xiàn)了多種水解酶，如糖苷酶、硫酸酯酶和蛋白酶，它們參與分解宿主難消化的聚糖和粘蛋白。有證據(jù)表明，多形擬桿菌BEVs以硫酸酯酶依賴性方式內(nèi)化于黏膜巨噬細(xì)胞。通過這種機(jī)制，BEVs可以穿過粘膜屏障，促進(jìn)細(xì)菌抗原和因子向免疫細(xì)胞的傳遞。多種研究集中在擬桿菌BEVs和膽固醇代謝之間的聯(lián)系上。棕櫚酸酯等飽和脂肪酸能刺激多形擬桿菌和脆弱擬桿菌菌株產(chǎn)生BEVs。此外，來自上述兩種細(xì)菌的BEVs均上調(diào)了介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞攝取膽固醇的類Niemann-Pick C1轉(zhuǎn)運(yùn)因子的表達(dá)。代謝組學(xué)分析表明，來自擬桿菌屬物種的(BEVs)在與宿主的相互作用中載有相關(guān)的代謝物。關(guān)于多形擬桿菌BEVs進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分析，預(yù)測了其代謝物的作用。這表明囊泡富含有助于腸道定植的代謝物，以及可納入小鼠代謝途徑的代謝物。對脆弱擬桿菌進(jìn)行的研究顯示，不同生產(chǎn)菌株BEVs的代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)含量存在顯著差異。脆弱擬桿菌菌株可以通過其產(chǎn)生鋅依賴的金屬蛋白酶毒素(BTF)的能力來區(qū)分。它們分為非產(chǎn)腸毒素型脆弱擬桿菌(NTBF)和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌(ETBF)。ETBF菌株引起腸道炎癥，在某些情況下可能導(dǎo)致結(jié)腸癌。毒素BTF通過BEVs作為表面暴露蛋白分泌。在這個(gè)位置，BTF通過疏水和靜電相互作用與宿主細(xì)胞膜的磷脂和多糖相互作用。除了毒力因子，NTBF和ETBF菌株的BEVs的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，非致病菌株的BEVs富含多糖利用所需的酶，這種代謝活動(dòng)對腸道生態(tài)有積極的貢獻(xiàn)。相反，來自ETBF的BEVs含有大量的分解代謝酶，這些酶屬于能量生成途徑，可以在腸道中長期存在。用同位素標(biāo)記葡萄糖進(jìn)行的流體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些通路在病原菌衍生的BEVs中是活躍的。
圖2 與擬桿菌衍生BEVs相關(guān)的代謝活動(dòng)有助于腸道生態(tài)和食物代謝。(a)指出了多形擬桿菌和脆弱擬桿菌BEVs中作為載體的酶對代謝的影響。(b)圖中顯示了腸上皮屏障和潛在的免疫系統(tǒng)。粘蛋白層(綠色)維持腔內(nèi)微生物和腸上皮之間的分離。藍(lán)色盒子將囊泡酶(紅色)與每個(gè)特定功能連接起來。SCFAs：短鏈脂肪酸，InsP6：磷酸肌醇。4.2 調(diào)節(jié)腸上皮屏障的完整性在腸道中，除了宿主來源的EVs，微生物BEVs還起著上皮屏障完整性的調(diào)節(jié)作用。這種調(diào)節(jié)對腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因?yàn)槠茐倪@種屏障會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增強(qiáng)，從而引起炎癥、過敏和代謝性疾病。腸道上皮起著物理屏障的作用，限制腔內(nèi)微生物和抗原進(jìn)入宿主組織，而不干擾離子通過細(xì)胞旁間隙。調(diào)控上皮屏障功能的一個(gè)重要機(jī)制是相鄰IECs之間緊密連接(TJs)的形成。TJs通過跨膜蛋白(包括occludin、claudin、tricellulin和連接粘附分子)在極化上皮的頂端建立細(xì)胞間連接。這些蛋白通過胞質(zhì)蛋白ZO-1和ZO-2錨定在肌動(dòng)蛋白骨架上。腸道病原體會(huì)導(dǎo)致TJs紊亂，這是其感染機(jī)制的一部分，而某些菌群菌株會(huì)強(qiáng)化TJs結(jié)構(gòu)，作為維持腸道屏障完整性的機(jī)制。除了TJs，IEC之間還有其他的連接結(jié)構(gòu)，即粘附連接、縫隙連接和橋粒連接。腸道微生物種群的一些研究顯示了微生物BEVs作為上皮屏障完整性的調(diào)節(jié)劑的作用。對于腸道大腸桿菌分離株，益生菌EcN因其公認(rèn)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性而被廣泛研究，有助于微生物群平衡。益生菌EcN通過調(diào)節(jié)TJ蛋白ZO-1、ZO-2、claudin-14和橋粒蛋白pinin來加強(qiáng)上皮屏障。Hering及其同事的研究表明，觸發(fā)claudin-14上調(diào)的益生菌因子是分泌蛋白TcpC，它激活ERK1/2信號通路。我們的研究包括其他腸源性大腸桿菌菌株，如ECOR12(A組;TcpC陰性)、ECOR63(B2組;TcpC陽性)。我們已經(jīng)證明，大腸桿菌菌株釋放的BEVs通過直接和間接機(jī)制以菌株特異性的方式調(diào)節(jié)上皮屏障的完整性。在結(jié)腸單層細(xì)胞系中，EcN和ECOR63產(chǎn)生的BEVs通過上調(diào)TJs蛋白ZO-1和claudin-14的表達(dá)來增強(qiáng)上皮屏障功能。此外，來自兩個(gè)菌株的BEVs通過下調(diào)claudin-2來調(diào)節(jié)屏障通透性。這些調(diào)節(jié)活動(dòng)不依賴于以游離可溶性蛋白形式分泌的TcpC。相反，ECOR12 BEVs對上皮屏障完整性沒有影響。研究了EcN和ECOR63 (BEVs)在腸致病性大腸桿菌感染引起的上皮屏障功能障礙細(xì)胞模型中的保護(hù)作用。在這個(gè)模型中，兩個(gè)大腸桿菌株的BEVs都能夠通過激活影響TJs蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的補(bǔ)償性調(diào)控機(jī)制，保護(hù)上皮屏障的完整性免受EPEC感染。具體而言，BEVs抵消了occludin和claudin-14 mRNA表達(dá)的改變，保留了細(xì)胞邊界TJs中的ZO-1和occludin，并改善了F-actin細(xì)胞骨架的破壞。在人體腸道中，上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用對維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在此背景下，我們已經(jīng)證明，腸道大腸桿菌菌株釋放的BEVs激活腸粘膜中其他協(xié)同增強(qiáng)上皮屏障的機(jī)制(圖3)。在人結(jié)腸外植體中，EcN BEVs激活I(lǐng)L-22的表達(dá)。這種細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞產(chǎn)生粘蛋白來幫助保護(hù)上皮屏障的完整性。在實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型中，EcN BEVs的口服給藥保留了粘膜的結(jié)腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種作用可能歸因于三葉因子3(TFF3)的上調(diào)，這是一種參與上皮修復(fù)的生物活性肽。EcN BEVs的另一個(gè)屏障保護(hù)機(jī)制是下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，這種酶通過擾亂IECs之間的TJs促進(jìn)腸道炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致腸道通透性增加和隨后的促炎效應(yīng)。微生物群多樣性的減少，特別是革蘭氏陰性細(xì)菌嗜粘蛋白艾克曼氏菌數(shù)量的減少，與炎癥性腸病的發(fā)展有關(guān)。這種微生物是人體腸道中的大量共生菌，通過將腸粘蛋白降解為短鏈脂肪酸(SCFAs)來為宿主提供代謝利益。有趣的是，SCFAs也是控制食欲和進(jìn)食的重要分子。此外，嗜粘蛋白艾克曼氏菌還有其他與腸道屏障增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的有益特性。與此一致的是，在接觸葡聚糖硫酸鈉(DSS)之前預(yù)先給小鼠注射嗜粘蛋白艾克曼氏菌可減輕結(jié)腸炎癥。基于同一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯勘砻?，嗜粘蛋白艾克曼氏菌釋放的BEVs介導(dǎo)了所觀察到的保護(hù)作用。通過減少結(jié)腸組織中免疫細(xì)胞的浸潤和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，口服給藥分離的BEVs可以改善結(jié)腸炎癥狀。如上所述，上皮屏障破壞后腸道通透性增加，允許內(nèi)毒素和管腔抗原進(jìn)入腸固有層。這種交易引發(fā)了粘膜免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性輕度炎癥，促進(jìn)代謝紊亂，擁有屬性非脂肪肝疾病和胰島素抵抗，導(dǎo)致2型糖尿病，最終導(dǎo)致肥胖。宏基因組學(xué)分析顯示，肥胖和2型糖尿病患者中嗜酸性黃曲霉的含量減少，而且他們的糞便樣本中含有較少的嗜粘蛋白艾克曼氏菌來源的MVs。在高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，研究了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs在調(diào)節(jié)腸道通透性中的作用，并與喂食正常飲食的對照組小鼠進(jìn)行了比較。嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs的口服給藥改善了所有由HFD引起的改變，影響了腸道通透性和代謝功能。此外，細(xì)菌胞外囊泡(BEVs)恢復(fù)了腸道屏障，上調(diào)了改變的TJs蛋白封閉蛋白ZO-1和緊密連接蛋白-5。通過免疫印跡技術(shù)證實(shí)了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs occludin的轉(zhuǎn)錄激活作用，這種激活作用發(fā)生在受到LPS攻擊的Caco-2單層細(xì)胞中。在代謝效應(yīng)方面，經(jīng)過處理的小鼠體重減輕，葡萄糖耐量增加。這些新陳代謝的結(jié)果歸因于恢復(fù)了屏障的完整性，因?yàn)樵诮o藥后的6小時(shí)內(nèi)，在結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)了BEVs，但在肝臟、肌肉、脂肪組織、胰腺或脾臟中沒有發(fā)現(xiàn)BEVs。其他的研究也證實(shí)了在喂食HFD小鼠時(shí)，來源于粘液分泌的BEVs的有益作用。他們可以減少體重增加，脂肪組織炎癥，血糖和膽固醇水平。此外，接種粘膜嗜酸鏈球菌BEVs的動(dòng)物表現(xiàn)出ZO-1、occludin-1和claudins-1的上調(diào)表達(dá)。有趣的是，嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs比活細(xì)菌引起更強(qiáng)的效果。作者證實(shí)了人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2中嗜粘蛋白艾克曼氏菌胞外囊泡(BEVs)上調(diào)ZO-1、ZO-2和claudins-4的表達(dá)?？偟膩碚f，這些研究指出了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs對炎癥性疾病的治療潛力，其作為腸道屏障完整性的積極調(diào)節(jié)因子，從而減輕炎癥。
圖3 微生物BEVs對腸上皮屏障的調(diào)節(jié)作用。腸上皮示意圖，其中緊密連接(TJ)蛋白由連接相鄰腸上皮細(xì)胞(IECs)的彩色條表示。大腸桿菌Nissle 1917 (EcN)和ECOR63(左圖)或A.
muciniphila(右圖)釋放的BEVs通過內(nèi)層黏液層遷移到上皮。下圖顯示了已知BEVs激活的影響腸屏障完整性的調(diào)節(jié)機(jī)制，以說明證據(jù)是從體外實(shí)驗(yàn)(IECs培養(yǎng))還是腸道通透性增加的體內(nèi)模型(實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎和高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病模型)中獲得的。紅色箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)/下調(diào)。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珺EVs抵消疾病改變的有益作用用藍(lán)色箭頭表示?？傮w而言，微生物BEVs介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致腸上皮屏障加強(qiáng)和隨后腸道通透性降低。本節(jié)討論了共生菌和益生菌衍生的BEVs對調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的作用。我們在本部分將解釋微生物BEVs通過腸上皮間接激活免疫細(xì)胞的機(jī)制，以及微生物BEVs與免疫細(xì)胞直接相互作用的機(jī)制。本節(jié)中描述的主要機(jī)制在圖4中進(jìn)行了總結(jié)。
圖4 微生物BEVs對腸道免疫調(diào)節(jié)作用的示意圖。該圖顯示腸上皮被黏蛋白層覆蓋，阻止腔內(nèi)微生物進(jìn)入，同時(shí)允許BEVs通過。單層上皮下可見固有層的免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)。微生物來源的BEVs通過兩種主要機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。(i)通過腸上皮非直接激活免疫細(xì)胞(左圖)。腸上皮細(xì)胞(IECs)內(nèi)化EVs激活胞質(zhì)受體NOD1，觸發(fā)免疫效應(yīng)因子的分泌，進(jìn)而刺激腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。微生物BEVs對NOD1信號通路的激活作了更詳細(xì)地展示。BEVs通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)化，并將NOD1(灰色圓柱體)募集到早期核內(nèi)體。激活的NOD1與特異性激酶RIP2(紅圈)相互作用，導(dǎo)致NF-kB的激活和隨后參與炎癥反應(yīng)的宿主基因上調(diào)(IL-6，IL-8)。(ii)腸道微生物群BEVs直接激活腸道駐留免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫介質(zhì)和IgA的分泌(中間方案)。除了與微生物群BEVs的直接相互作用外，樹突狀細(xì)胞(DCs)還通過在上皮細(xì)胞層延伸偽足而與管腔BEVs相互作用(右圖)。對幾種腸道微生物的研究表明，BEVs以菌株特異性方式激活DCs。從益生菌和共生大腸桿菌中分離得到的BEVs具有特異性免疫調(diào)節(jié)作用，DCs中miRNAs的差異調(diào)節(jié)是其中的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。綜上，DCs整合微生物群BEVs傳入的信號，并建立特定的程序，促進(jìn)na?ve T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞(Th1，Th2，Th17，Th22)或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，從而協(xié)調(diào)適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞反應(yīng)。4.3.1 微生物BEVs通過腸上皮激活免疫反應(yīng)共生細(xì)菌對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)已在體外細(xì)胞模型中進(jìn)行了研究，該模型旨在模擬體內(nèi)腸道中發(fā)生的情況。這些模型旨在重現(xiàn)腸道微生物群、腸道上皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用，并由上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞在Transwell裝置中共培養(yǎng)組成。人類單層IECs生長在模擬腸上皮屏障的上腔，在模擬固有層底層免疫系統(tǒng)的基底側(cè)腔培養(yǎng)未成熟的樹突狀細(xì)胞(或其他免疫細(xì)胞)。在該模型中，利用活菌對乳酸菌進(jìn)行根尖刺激，以評估其益生菌特性。隨后，類似的模型被用來研究微生物BEVs作為免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。在此背景下，我們研究了益生菌EcN和共生大腸桿菌BEVs在Caco-2/外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)共培養(yǎng)作為模擬完整腸黏膜模型的根尖刺激后，BEVs的免疫調(diào)節(jié)作用。作為比較，直接刺激PBMCs作為腸屏障破壞模型。分析了基底外側(cè)腔室中幾種細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，并評估了它們在Caco-2細(xì)胞和PBMCs中的表達(dá)。盡管BEVs和細(xì)菌裂解液都能激活按屏障破壞模型處理的PBMCs中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10和MIP1α的表達(dá)，但在共培養(yǎng)模型中，只有BEVs能誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用。這證明Caco-2細(xì)胞形成的上皮屏障阻止了細(xì)菌效應(yīng)分子直接接觸到基礎(chǔ)PBMCs，而且PBMCs被上皮細(xì)胞分泌的因子激活，以響應(yīng)BEVs。這項(xiàng)研究表明微生物群衍生的BEVs能夠通過腸上皮屏障觸發(fā)信號事件。在人結(jié)腸組織中，BEVs能上調(diào)這些細(xì)胞因子的表達(dá)。其他免疫介質(zhì)的表達(dá)分析也在這個(gè)體外模型中進(jìn)行了探討。如上所述(第4.2節(jié))，來自EcN和共生ECOR12的BEVs在這個(gè)體外模型中激活了腸屏障效應(yīng)因子(如IL-22和抗菌肽β-防御素-2)的表達(dá)。相反，來自這些菌株的BEVs觸發(fā)了TGF-β和促炎細(xì)胞因子IL-12的下調(diào)。TGF-β是一種多效性細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中具有相關(guān)調(diào)節(jié)作用。這種細(xì)胞因子引發(fā)Treg細(xì)胞的分化，具有抗炎特性。然而，在IL-6存在下，TGF-β促進(jìn)了促炎性Th17。這些表型的不平衡導(dǎo)致Th17細(xì)胞的過度產(chǎn)生可能導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)展，包括IBD。在這種情況下，由這些微生物菌株的BEVs引起的TGF-β水平的降低可能有助于恢復(fù)炎癥條件下的Th17/Treg平衡。Th17細(xì)胞也影響結(jié)腸細(xì)胞黏蛋白-1的分泌。我們發(fā)現(xiàn)，來自EcN和ECOR12的BEVs觸發(fā)了結(jié)腸組織中這種膜相關(guān)粘蛋白的下調(diào)。粘蛋白-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β在多種癌癥中高表達(dá)。某些腸道有益細(xì)菌對這些標(biāo)志物的調(diào)節(jié)可能反映微生物BEVs對癌癥進(jìn)展或治療效果的影響。總之，這些發(fā)現(xiàn)支持微生物群來源的BEVs在通過腸上皮屏障激活免疫和防御反應(yīng)中的作用。這證明BEVs是腸道細(xì)菌與腸黏膜細(xì)胞進(jìn)行通訊和調(diào)節(jié)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的有效策略。除了體外模型，益生菌EcN的有益特性已經(jīng)在結(jié)腸炎小鼠模型中得到證實(shí)?？诜o藥對經(jīng)DSS處理的小鼠結(jié)腸炎癥狀、組織學(xué)評分、腸道通透性和炎癥反應(yīng)的改善作用與活益生菌相同。除了抵消組織修復(fù)和傷口愈合標(biāo)志物的表達(dá)改變，EcN MVs介導(dǎo)了抗炎作用。BEVs降低了升高的促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-17和INF-γ的表達(dá)，增加了抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。這種有益作用還與與損傷和炎癥相關(guān)的酶的下調(diào)有關(guān)，如環(huán)氧化酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。與嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs一樣，益生菌EcN的囊泡可能是一種安全的益生菌衍生策略，通過靶向腸道炎癥過程來保護(hù)胃腸道健康。有證據(jù)表明，來自革蘭氏陽性細(xì)菌的BEVs對內(nèi)皮細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。Kefir衍生菌株Lactobacillus kefir、Lactobacillus
kefiranofaciens和Lactobacillus kefirgranum在體外和體內(nèi)炎癥條件下減輕炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。用從這些菌株分離的BEVs處理TNF-α刺激Caco-2細(xì)胞，在mRNA和蛋白分泌水平上顯著減少了促炎細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生。機(jī)制涉及通過減少NF-kBp65亞基磷酸化來抑制TNF-α信號通路。在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中，給予Kefir乳桿菌衍生的BEVs可減輕疾病癥狀和組織損傷評分。這些囊泡還減少了炎癥性疾病相關(guān)的氧化應(yīng)激，因?yàn)橛肂EVs治療的小鼠血清中髓過氧化物酶水平顯著降低。有證據(jù)表明NOD受體參與了由BEVs激活的內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)的分子機(jī)制和信號通路。這些胞漿受體對維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。它們在宿主對細(xì)菌病原體的防御反應(yīng)和調(diào)節(jié)對微生物群的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮相關(guān)作用。NOD1檢測主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌肽聚糖中的D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid。NOD2能檢測到普遍存在于所有細(xì)菌肽聚糖分子中的胞壁酰二肽。鑒于腸道微生物群主要由非侵襲性細(xì)菌組成，人們提出了幾種途徑介導(dǎo)肽聚糖進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)菌分裂時(shí)釋放到腸腔的肽聚糖片段可以通過內(nèi)吞作用或特定的膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化到IECs中。另一種途徑主要是研究革蘭氏陰性病原體，涉及通過BEVs傳遞肽聚糖。在益生菌和共生大腸桿菌菌株中，研究了腸道菌群的BEVs對NOD受體的激活作用。上述研究發(fā)現(xiàn)，從益生菌EcN和共生菌ECOR12中分離的BEVs激活了內(nèi)皮細(xì)胞中NOD1信號通路。一些實(shí)驗(yàn)方法被用來證實(shí)這種細(xì)胞溶素受體參與細(xì)胞對內(nèi)化的BEVs的反應(yīng)。這些方法包括使用特異性siRNA沉默NOD1，以及使用NOD1通路特異性激酶的抑制劑。這兩種方法均能顯著阻斷囊泡介導(dǎo)的NF-κB活化，從而降低IL-6和IL-8的表達(dá)。此外，來自兩個(gè)微生物菌株的BEVs與NOD1在早期核內(nèi)體中共定位。與NOD1的相互作用導(dǎo)致NOD在細(xì)胞質(zhì)中形成聚集體，隨后RIP2激酶的招募啟動(dòng)磷酸化級聯(lián)，導(dǎo)致NF-κB活化。這種轉(zhuǎn)錄因子激活炎癥反應(yīng)中涉及的基因，通過釋放趨化因子和其他免疫效應(yīng)物傳遞到腸道常駐免疫細(xì)胞。這項(xiàng)研究證明腸道有益菌的EVs是肽聚糖傳遞到宿主細(xì)胞質(zhì)的一種機(jī)制。在IECs中，微生物群BEVs對NOD受體的持續(xù)刺激可以穩(wěn)定地啟動(dòng)先天免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致控制炎癥反應(yīng)，幫助根除病原體和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。4.3.2 微生物BEVs直接激活免疫細(xì)胞為了維持腸道平衡，免疫系統(tǒng)必須對外部抗原作出反應(yīng)，并觸發(fā)免疫反應(yīng)，以保護(hù)宿主免受病原體或傷害。腸道微生物群和宿主黏膜免疫系統(tǒng)相互作用強(qiáng)烈，對人類健康具有重要意義。如上所述，腸道上皮是微生物向免疫細(xì)胞傳遞信號的間接傳遞者。然而，腸道相關(guān)淋巴組織的特化細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞(DCs)，可以直接與腸道微生物相互作用，并指導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。因此，DCs通過協(xié)調(diào)宿主對腸道微生物的免疫反應(yīng)，在連接先天反應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮相關(guān)作用，確保腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。正如第4.1節(jié)所提到的，在食物代謝和腸道生態(tài)中，脆弱擬桿菌是腸道共生菌和眾所周知的具有益生活性的菌株。在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中證實(shí)了該菌株的免疫調(diào)節(jié)作用。灌胃脆弱擬桿菌可通過抑制炎癥分子的活性和誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)展。第一個(gè)證明共生細(xì)菌BEVs有益作用的研究集中在脆弱擬桿菌。研究者發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌的BEVs中含有莢膜多糖A(PSA)。在小鼠結(jié)腸炎模型中，用野生脆弱擬桿菌(BEVs)治療的動(dòng)物與用PSA缺陷突變型BEVs治療的動(dòng)物相比，疾病評分和癥狀得到改善。在分子機(jī)制方面，BEVs中PSA的含量與Treg細(xì)胞的活化有很強(qiáng)的相關(guān)性。這一點(diǎn)在體外模型中得到了證實(shí)，即骨髓源DCs與脆弱擬桿菌的BEVs，然后與na?ve
T細(xì)胞共同培養(yǎng)。用野生型BEVs刺激的DCs可以增加CD4 CD25 FOXP3 T細(xì)胞數(shù)量和IL-10的產(chǎn)生，而用PSA突變株BEVs刺激的DCs則不能。這些免疫調(diào)節(jié)作用是通過PSA在DCs中激活TLR2通路而實(shí)現(xiàn)的。通過微陣列分析比較野生型BEVs或ΔPSA BEVs誘導(dǎo)的DCs的mRNA水平，可以鑒定出通過TLR2依賴性方式受PSA調(diào)節(jié)的基因。另一項(xiàng)研究表明，除TLR2之外的免疫受體參與了脆弱擬桿菌BEVs在DCs中激活的信號傳導(dǎo)事件。這項(xiàng)研究關(guān)注克羅恩病(CD)的風(fēng)險(xiǎn)基因。CD4 T細(xì)胞與野生型、ATG16l1缺陷型或NOD2/敲除型小鼠共培養(yǎng)結(jié)果表明，BEVs的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于功能性ATG16l1和NOD2誘導(dǎo)的非典型自噬途徑，這種途徑對結(jié)腸炎的防治至關(guān)重要。事實(shí)上，ATG16l1缺陷的DCs并沒有引起Tregs對BEVs的反應(yīng)。進(jìn)一步的分析表明，脆弱擬桿菌利用非典型自噬途徑LAP介導(dǎo)耐受性反應(yīng)。同樣，NOD2敲除的骨髓來源DCs未能通過減少IL-10的產(chǎn)生誘導(dǎo)Treg反應(yīng)，這反過來削弱了對粘膜炎癥的抑制。該研究還表明，來自與CD發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的ATG16L1的T300A變體的人體免疫細(xì)胞在脆弱擬桿菌BEVs的Treg反應(yīng)中存在缺陷。多形擬桿菌的免疫調(diào)節(jié)特性已在用活菌懸浮液治療的CD臨床前模型中得到證明。BEVs在介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用中的作用最近在一項(xiàng)研究中得到證實(shí)，該研究在源自健康個(gè)體和CD或潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者的DCs中使用多形擬桿菌BEVs刺激。BEVs可誘導(dǎo)正常結(jié)腸樹突狀細(xì)胞表達(dá)IL-10，可作為健康狀態(tài)的指標(biāo)。其中髓系CD11 DCs最多。在來源于健康供體外周血單個(gè)核細(xì)胞的DCs中，BEVs還激活了共刺激標(biāo)志物CD80和IL-6的表達(dá)。與此相反，多形擬桿菌BEVs未能誘導(dǎo)IBD患者結(jié)腸DCs IL-10。這與CD103 (DCs)數(shù)量減少相關(guān)。疾病的活動(dòng)性也影響IBD的調(diào)節(jié)反應(yīng)。在此背景下，這項(xiàng)研究表明，來自非活性和活動(dòng)性UC患者的血源來源DCs表現(xiàn)出IL-10水平的變化。非活動(dòng)性疾病患者的樹突狀細(xì)胞IL-10水平降低。相反，來自活動(dòng)性疾病患者的DCs表現(xiàn)出與健康對照組相當(dāng)?shù)腎L-10水平。這表明對這種共生體的免疫反應(yīng)的內(nèi)在改變在IBD中很重要。這項(xiàng)研究表明，來自多形擬桿菌的BEVs可以促進(jìn)健康個(gè)體對微生物群的平衡免疫反應(yīng)。然而，這種反應(yīng)在IBD狀態(tài)下改變，從而導(dǎo)致腸道內(nèi)的炎癥環(huán)境。普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)mpk是擬桿菌科的另一種腸道共生菌，具有賦予免疫調(diào)節(jié)特性的相關(guān)特征。事實(shí)上，這種共生體改善了幾種IBD小鼠模型的結(jié)腸炎。普通擬桿菌mpk誘導(dǎo)有益免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制尚未完全確定，但最近的一項(xiàng)研究表明，分泌的BEVs誘導(dǎo)骨髓源性DCs產(chǎn)生耐受的半成熟表型。值得注意的是，普通擬桿菌BEVs對CD11c DCs產(chǎn)生了與活體共生體相同的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，因?yàn)闊o論是普通擬桿菌mpk刺激的DCs還是分離的BEVs刺激的DCs，其MHC-II、CD40、CD80和CD86標(biāo)志物的表達(dá)水平均無差異。以toll樣受體2(Tlr2-/-)、Tlr4-4(Tlr4-/-)或兩者兼有的toll樣受體(Tlr2-/-和Tlr4-/-)缺失小鼠的DCs為模型，探討B(tài)EVs介導(dǎo)的作用機(jī)制。這兩種受體的缺失都影響了囊泡抗原的識別，并隨后將未成熟的DCs轉(zhuǎn)化為半成熟狀態(tài)，這與MHC-II和TNF-α的表達(dá)減少有關(guān)。作者認(rèn)為，普通擬桿菌mpk BEVs中的TLR-2和TLR-4配體的存在可能通過使宿主對內(nèi)毒素的刺激脫敏而促進(jìn)DCs的耐受。然而，然而，這一共生體中包含的BEVs中的TLR2配體的性質(zhì)仍不清楚。如前所述，益生菌胞外蛋白具有許多有益的作用，有助于腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和微生物群平衡。許多研究已經(jīng)闡明了這種益生菌的免疫調(diào)節(jié)和屏障增強(qiáng)作用的機(jī)制和分子因素。在前面的章節(jié)中，我們回顧了由EcN菌BEVs激活的機(jī)制，這些機(jī)制提供了對IBD的保護(hù)，并強(qiáng)調(diào)了它們在IECS中作為腸屏障完整性和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的作用。本節(jié)描述了目前關(guān)于EcN和其他腸道駐留大腸桿菌對DCs和衍生免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用的知識。科學(xué)家們的研究結(jié)果表明，來自EcN菌和共生大腸桿菌菌株的BEVs能夠以菌株特異性的方式激活DCs，促進(jìn)T細(xì)胞亞群的分化。BEVs均顯著增加Th反應(yīng)細(xì)胞因子的分泌：INF-γ、IL-12、IL-18(Th1)、IL-6、IL-23、TNF-α、IL-1β(Th17/Th22)、IL-10和TGF-β(Treg)。EcN和ECOR63的囊泡比ECOR12或細(xì)胞毒性ECOR53的BEVs更能誘導(dǎo)Th1極化細(xì)胞因子的分泌。相反，ECOR12 BEVs誘導(dǎo)了高水平的Treg相關(guān)細(xì)胞因子。在體外共培養(yǎng)的DC/CD4 T細(xì)胞模型中，我們評估了活化的DCs對CD4 T細(xì)胞活化的差異作用。特異性T細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞因子定量和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析證明，來自所有菌株的BEVs通過釋放IL-4、IL-5和IL-13激活Th2應(yīng)答。與其他菌株的BEVs相比，ECOR12的BEVs誘導(dǎo)了較強(qiáng)的Treg反應(yīng)，其TGF-β水平較高，促炎細(xì)胞因子表達(dá)較低。這項(xiàng)研究表明，在腸道中，微生物菌株釋放的BEVs通過特異性激活DCs穩(wěn)定啟動(dòng)先天免疫系統(tǒng)，進(jìn)而協(xié)調(diào)平衡的免疫耐受和免疫炎癥反應(yīng)，這些反應(yīng)對于保持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。與EcN的有益作用相一致，益生菌產(chǎn)生的BEVs驅(qū)動(dòng)Th反應(yīng)：Th2(對胞外寄生蟲和過敏性炎癥反應(yīng)的免疫)、Th22(組織保護(hù))、Th1(促炎癥，對病原體的保護(hù)性免疫)、Th17(促炎癥，抗微生物反應(yīng))和Treg(免疫耐受)反應(yīng)。其他共生B2大腸桿菌菌株觸發(fā)類似的Th反應(yīng)，但具有更強(qiáng)的促炎作用。相比之下，ECOR12 BEVs主要通過增加Treg/Th17平衡來促進(jìn)宿主對腸道微生物的耐受，并通過激活Th22反應(yīng)來保護(hù)腸道完整性。然而，它們不能觸發(fā)針對病原體的適當(dāng)Th1反應(yīng)。微生物源性BEVs利用調(diào)控機(jī)制特異性激活DCs引發(fā)適當(dāng)T細(xì)胞應(yīng)答是復(fù)雜的，尚未完全闡明。與BEVs激活的信號通路相關(guān)的幾個(gè)分子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和共刺激分子，導(dǎo)致DCs具有不同的激活特性。在這種情況下，miRNAs作為免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子具有相關(guān)的作用，可以微調(diào)信號通路。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行了深度RNA測序，以確定差異表達(dá)的DCs與來自EcN或ECOR12的BEVs。這項(xiàng)研究揭示了來自兩個(gè)菌株的BEVs調(diào)節(jié)的一組共同的miRNA。此外，BEVs因生產(chǎn)菌株不同而引起特定miRNA的差異表達(dá)(EcN BEVs下調(diào)21個(gè)，上調(diào)21個(gè)；ECOR12 BEVs下調(diào)45個(gè)，上調(diào)41個(gè))。MiRNA及其靶標(biāo)的差異表達(dá)與這些BEVs對DCs的作用一致。這些效應(yīng)與ECOR12 BEVs驅(qū)動(dòng)DCs協(xié)調(diào)T調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力是一致的，這對腸道的免疫耐受至關(guān)重要。因此，微生物群BEVs對miRNA的差異調(diào)節(jié)通過免疫訓(xùn)練來維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。革蘭氏陽性益生菌：乳桿菌屬和雙歧桿菌。迄今為止，大多數(shù)被記錄為益生菌的微生物是革蘭氏陽性菌。其中，乳桿菌屬和雙歧桿菌屬由于具有促進(jìn)健康和免疫調(diào)節(jié)作用而被廣泛研究和應(yīng)用。活益生菌的懸浮液對免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的影響已被廣泛研究。然而，很少有研究關(guān)注它們的BEVs的益生活性。科學(xué)家們在小鼠模型上研究了鼠李糖乳桿菌BEVs的免疫調(diào)節(jié)作用。該研究證明鼠李糖乳桿菌JB-1衍生的BEVs具有與活體益生菌相同的免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)元刺激作用。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)元反應(yīng)的調(diào)節(jié)依賴于IECs對BEVs的反應(yīng)所釋放的信號。這些結(jié)果證實(shí)了IECs作為微生物群和腸粘膜下層細(xì)胞間接通訊的介質(zhì)的關(guān)鍵作用。腸道粘膜組織分泌的IgA在調(diào)節(jié)微生物群落組成和防止腸道病原體入侵方面起著重要作用。腸道免疫細(xì)胞產(chǎn)生IgA是由益生乳桿菌菌株如Lactobacillus sakei subsp.
sakei NBRC15893激活的。在從小鼠Peyer氏斑中分離的細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明，介導(dǎo)這種效果的益生菌因子與純化的BEVs有關(guān)。因此，通過增強(qiáng)IgA的表達(dá)，BEVs還可以作為腸道有益菌增強(qiáng)腸道屏障和調(diào)節(jié)腸道微生物組合的機(jī)制。有證據(jù)表明，雙歧桿菌屬的益生菌除了對結(jié)腸炎有保護(hù)作用外，還可以減輕過敏反應(yīng)。雙歧桿菌菌株對DCs的激活以及隨后的na?veCD4 T細(xì)胞極化為效應(yīng)反應(yīng)在菌株之間是不同的。具體來說，益生菌Bifidobacterium bifidumLMG13195觸發(fā)耐受性反應(yīng)。通過對幾種益生菌亞細(xì)胞組分對DCs的影響分析，證明這些作用是由BEVs特異性介導(dǎo)的。與B. bifidum LMG13195相似，BEVs激活DCs促進(jìn)Treg細(xì)胞(FOXP3 )分化并誘導(dǎo)比Th1/Th17促炎細(xì)胞因子更高水平的IL-10。基于其抑制作用，作者認(rèn)為這種益生菌的BEVs可能作為過敏原特異性免疫治療的佐劑。食物過敏是由于對食物成分的免疫反應(yīng)異常引起的，一些益生菌可以減輕癥狀和相關(guān)的炎癥。在這種背景下，在一個(gè)由過敏原引起的食物過敏伴急性腹瀉的小鼠模型中評估了長雙歧桿菌的治療潛力。這種益生菌可以通過減少小腸中肥大細(xì)胞的數(shù)量來改善炎癥，而不會(huì)抵消Th2反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，該活性是由Bifidobacterium longum衍生的BEVs介導(dǎo)的，特別是由囊泡蛋白ESBP所介導(dǎo)，該蛋白觸發(fā)了骨髓來源的肥大細(xì)胞的凋亡。5 BEVs在腸道上皮中的轉(zhuǎn)運(yùn)有相當(dāng)多的證據(jù)表明，腸道微生物群衍生的化合物存在于血液中，可以通過身體分布，到達(dá)遠(yuǎn)端器官和組織。BEVs是共生腸道微生物群釋放的因子之一。這些囊泡可以穿過上皮屏障進(jìn)入下層粘膜層，并與免疫細(xì)胞(如DCs和巨噬細(xì)胞)相互作用。此外，微生物BEVs可以通過全身或淋巴循環(huán)擴(kuò)散到腸外組織。這些腸道微生物群來源的BEVs如何到達(dá)遠(yuǎn)端器官的問題仍然沒有得到很好的探索。然而，在腸道微生物組及其對健康和疾病的影響方面，這是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。關(guān)于BEVs如何到達(dá)體循環(huán)的主要理論是基于腸漏的情況。擾亂腸道環(huán)境的許多因素引起腸道微生物群失衡。這種情況，被稱為腸道生態(tài)失調(diào)。腸道生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致上皮屏障破壞和隨后細(xì)胞旁通透性增加，允許BEVs通透到血液。Tulkens等科學(xué)家研究了腸道屏障功能障礙患者體循環(huán)中腸道微生物BEVs的存在，分析了來自無屏障功能障礙的健康獻(xiàn)血者和有明確腸道屏障功能障礙的患者。同一小組開發(fā)了一個(gè)詳盡的方案，從糞便和血液樣本中的真核衍生EVs中分離出BEVs。分析了分離樣品中BEVs的特異性特征，如超微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)組含量和是否存在MAMPs。這種純化過程保持了BEVs的完整性，適用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)和生化表征。然而，應(yīng)該考慮特定的設(shè)置，以便根據(jù)每種體液標(biāo)準(zhǔn)化隔離和處理方案。因此，它的應(yīng)用將有助于研究體液中的BEVs及其作為診斷工具的應(yīng)用。循環(huán)BEVs的存在可以解釋體液中細(xì)菌遺傳物質(zhì)的存在。一些研究已經(jīng)報(bào)道了健康獻(xiàn)血者血液樣本中存在基因組DNA。現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為血液不是無菌液體，而且人體血液中的微生物組在病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生改變。事實(shí)上，血液微生物組分析已經(jīng)被認(rèn)為是一種潛在的癌癥診斷方法。然而，當(dāng)基于序列的技術(shù)被用來研究低生物量樣品中的微生物群時(shí)，避免樣品處理過程中的污染是必要的。現(xiàn)在有大量的證據(jù)表明BEVs穿過細(xì)胞屏障并到達(dá)身體的每一個(gè)組織。其中一個(gè)例子是：來自腸道細(xì)菌的BEVs已經(jīng)在健康哺乳期母親的母乳中被檢測出來。有研究證據(jù)表明，微生物BEVs也能到達(dá)大腦。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋為什么盡管血腦屏障具有嚴(yán)格的通透性，但大腦中仍然存在細(xì)菌DNA。最近關(guān)注于腦-微生物群軸的研究表明，BEVs與多種腦疾病有關(guān)，如抑郁、焦慮、壓力、自閉癥和阿爾茨海默氏癥。在阿爾茨海默病小鼠模型中，血液中BEVs的16S rRNA宏基因組分析使得3000多個(gè)與腸道微生物群譜相關(guān)的分類單元得以鑒定。有趣的是，與作為對照的野生型小鼠相比，具有阿茲海默病型突變小鼠在某些微生物類群上發(fā)生了重要改變。基于實(shí)驗(yàn)組之間顯著的統(tǒng)計(jì)差異，科學(xué)家們建議血液BEVs的宏基因組學(xué)分析可以用于鑒定與特定疾病相關(guān)的腸道微生物群失衡。同樣，在患有自閉癥的人群中，從尿液樣本中分離出來的BEVs的基因組與健康對照組相比有很大的差異。這些差異也反映了先前在自閉癥中表征的腸道微生物組的變化，從而支持BEVs在體液中用于診斷目的的潛在應(yīng)用價(jià)值。
圖5 微生物來源BEVs跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。不同過程用不同編號并用紅色表示。腸道微生物釋放的BEVs通過內(nèi)吞作用被腸上皮細(xì)胞(IECs)吸收。內(nèi)化的BEVs可以到達(dá)IECs的基底外側(cè)膜，并通過胞吞作用進(jìn)入固有層。此外，細(xì)胞旁路途徑(3)也允許管腔BEVs通過下層黏膜下層。一旦進(jìn)入固有層，易位的BEVs直接與常駐腸道免疫細(xì)胞相互作用，觸發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。有證據(jù)表明，BEVs穿過內(nèi)皮屏障到達(dá)血管，從而分布到遠(yuǎn)端器官。大量關(guān)于這一主題的出版物、專門會(huì)議和論壇都強(qiáng)調(diào)了微生物群研究的相關(guān)性。盡管在這一領(lǐng)域有著大量的研究，但是關(guān)于微生物群相互作用的內(nèi)在機(jī)制，特別是那些關(guān)于向靶細(xì)胞傳遞效應(yīng)物的內(nèi)在機(jī)制仍然有許多未知。這些知識對于了解疾病和開發(fā)微生物群或微生物衍生產(chǎn)品對人類健康的轉(zhuǎn)化策略至關(guān)重要。在這種背景下，微生物BEVs的研究目前正受到越來越多的關(guān)注。來自動(dòng)物模型臨床前試驗(yàn)的證據(jù)表明，BEVs可能作為預(yù)防腸道感染或炎癥和免疫相關(guān)疾病的治療/營養(yǎng)策略。使用分離的BEVs將可能克服在免疫缺陷個(gè)體中使用活益生菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。腸道微生物群組成和多樣性的失衡與包括癌癥、神經(jīng)、代謝和免疫紊亂在內(nèi)的多種疾病有關(guān)。在這種背景下，腸道微生物組分析被認(rèn)為是一種潛在的、有用的診斷工具。在患者和健康人群的血液和尿液樣本中發(fā)現(xiàn)了腸道微生物群來源的BEVs，其特征與腸道微生物組高度相關(guān)，這為診斷提供了新的策略。微生物源EVs的研究正在迅速發(fā)展。預(yù)計(jì)在不久的將來，這一領(lǐng)域的研究將有助于了解復(fù)雜的微生物群-宿主通訊網(wǎng)絡(luò)，這對于保護(hù)人類健康至關(guān)重要，并為推動(dòng)基于腸道有益菌作為后生元的EVs的新治療策略奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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