撰文：huacishu

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亮點(diǎn)：

1、作者討論了目前對(duì)ecDNA的結(jié)構(gòu)以及它如何促進(jìn)癌基因表達(dá)的理解，包括與ecDNA染色質(zhì)組織和核定位相關(guān)的屬性；

2、作者描述了檢測(cè)和測(cè)序ecDNA的新工具的開發(fā)及其在癌癥中鑒定ecDNA結(jié)構(gòu)和豐度的用途；

3、作者討論了ecDNA染色質(zhì)組織的改變及其對(duì)癌基因調(diào)控的影響，提示這些新的ecDNA特性可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的致癌功能，這可能為治療干預(yù)提供了機(jī)會(huì)。

美國(guó)杰克遜基因醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室Roel G. W. Verhaak教授課題組在國(guó)際知名期刊Nat Rev Genet在線發(fā)表題為“Extrachromosomal DNA amplifications in cancer”的論文。染色體外DNA（ecDNA）擴(kuò)增是癌癥改變的重要驅(qū)動(dòng)因素。ecDNA的功能與其獨(dú)特的性質(zhì)有關(guān)，例如其圓形結(jié)構(gòu)與染色質(zhì)化和表觀遺傳調(diào)控景觀的改變有關(guān)，以及其在細(xì)胞分裂期間隨機(jī)分離的能力，這增加了細(xì)胞間拷貝數(shù)的異質(zhì)性。

在這篇綜述中，作者綜述了目前已知的ecDNA是如何生成的，以及其遺傳和表觀遺傳結(jié)構(gòu)如何影響癌癥中原癌基因的調(diào)控。作者還討論了最近發(fā)現(xiàn)的ecDNA功能如何影響腫瘤發(fā)生，強(qiáng)調(diào)其可以作為癌癥新的治療靶點(diǎn)。

原癌基因異常高表達(dá)是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志，它可由染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常引起。體細(xì)胞拷貝數(shù)改變是癌基因表達(dá)變化的最常見驅(qū)動(dòng)因素。染色體外DNA（ecDNA）是一種環(huán)狀DNA元件，已成為體細(xì)胞拷貝數(shù)擴(kuò)增的最重要形式之一。自1965年在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)ecDNA以來(lái)，在大規(guī)模DNA測(cè)序數(shù)據(jù)集中對(duì)ecDNA的重新評(píng)估表明，它存在于大多數(shù)癌癥類型中（圖1a）。與其他類型的局灶性擴(kuò)增相比，含有ecDNA的腫瘤患者的臨床結(jié)果更差，這證實(shí)了ecDNA元素的功能重要性。

兩個(gè)普遍接受的特征使ecDNA成為原癌基因擴(kuò)增的獨(dú)特且異常有效的載體。首先，它們的圓形結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄升高相關(guān)，與線性擴(kuò)增相比，導(dǎo)致原癌基因表達(dá)增加。其次，擺脫了染色體位置限制和缺少著絲粒，ecDNA不平等地分離到子細(xì)胞中，這可以快速增加ecDNA拷貝數(shù)并驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖1b）。因此，ecDNA代表了具有獨(dú)特分子特征的癌癥中癌基因擴(kuò)增的重要載體，其中大多數(shù)目前尚未完全了解。

在這篇綜述中，作者討論了目前對(duì)ecDNA的結(jié)構(gòu)以及它如何促進(jìn)癌基因表達(dá)的理解，包括與ecDNA染色質(zhì)組織和核定位相關(guān)的屬性。描述了檢測(cè)和測(cè)序ecDNA的新工具的開發(fā)及其在癌癥中鑒定ecDNA結(jié)構(gòu)和豐度的用途。討論了ecDNA染色質(zhì)組織的改變及其對(duì)癌基因調(diào)控的影響，作者認(rèn)為，這些新的ecDNA特性可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的致癌功能，這可能為治療干預(yù)提供了機(jī)會(huì)。

ecDNA的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

合成和擴(kuò)增

當(dāng)產(chǎn)生的染色體異常包含原癌基因或?yàn)榧?xì)胞提供增殖或生存優(yōu)勢(shì)的致癌調(diào)節(jié)元件時(shí)，就會(huì)發(fā)生克隆選擇。據(jù)報(bào)道，至少有70個(gè)基因組區(qū)域在癌癥中被反復(fù)擴(kuò)增，包括含有原癌基因的位點(diǎn)，如EGFR、MYC、MYCN和CCND2。在癌癥中以高拷貝數(shù)水平進(jìn)行局部擴(kuò)增的大多數(shù)基因在腫瘤子集中被染色體外擴(kuò)增，在所有新診斷和未治療的癌癥中有14%檢測(cè)到ecDNAs（圖1a）。一些ecDNA只包含增強(qiáng)子而不包含基因，這表明選擇含有ecDNA的腫瘤細(xì)胞可以基于ecDNA的作用，而不僅僅是激活癌基因表達(dá)。

由于基因組中隨機(jī)位置的DNA損傷以及錯(cuò)誤修復(fù)，可能會(huì)出現(xiàn)局部擴(kuò)增。在其最簡(jiǎn)單的形式中，ecDNA元件由通過(guò)端到端連接循環(huán)的兩個(gè)DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生的單個(gè)染色體DNA片段組成（圖2）。更常見的是，ecDNA由來(lái)自不同染色體的數(shù)十到數(shù)百個(gè)分離的DNA片段組成，重組成單個(gè)元素（圖2）。復(fù)雜的ecDNA結(jié)構(gòu)形成至少與兩種機(jī)制有關(guān)：第一，染色體破碎，產(chǎn)生聚集重排并導(dǎo)致ecDNA形成，在原發(fā)性癌癥中檢測(cè)到的約36%的ecDNA中，染色體三聯(lián)體的足跡證明了這一點(diǎn)；第二，斷裂-融合-橋循環(huán)（BFB），如在一些ecDNA上發(fā)現(xiàn)的頭對(duì)頭折回反轉(zhuǎn)所證明（圖2）。

分布

ecDNA分子的數(shù)量因細(xì)胞而異，這意味著有絲分裂期間ecDNA的分離不均勻（圖1b）。ecDNAs中沒有著絲粒，在細(xì)胞周期的中期無(wú)絲分裂階段，通過(guò)紡錘體復(fù)合力阻止了均勻的有絲分裂分布。然而，如果有絲分裂后子細(xì)胞的細(xì)胞核中不包含ecDNA元素，它們就會(huì)被微核所包裹。因此，需要存在確保有絲分裂ecDNA分布的機(jī)制。ecDNA在S期早期復(fù)制，這一特性通常與活性轉(zhuǎn)錄相關(guān)（圖3）。在DNA復(fù)制開始時(shí)，ecDNA分子從核周邊重新定位到核中心，這可能意味著存在ecDNA特異性復(fù)制機(jī)制。在M期和分離期間，ecDNA優(yōu)先結(jié)合線性染色體的端粒區(qū)域。

在患者腫瘤中已觀察到適應(yīng)性反應(yīng)，其中含ecDNA的亞克隆在靶向治療下迅速縮小，但在治療壓力消除后重新出現(xiàn)。在應(yīng)激條件下，動(dòng)態(tài)降低和增加ecDNA水平的能力可能特別有效，其中可能包括腫瘤微環(huán)境中遇到的缺氧和高酸度。表觀遺傳狀態(tài)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，可促進(jìn)EGFR位點(diǎn)的瞬時(shí)位點(diǎn)特異性拷貝數(shù)增加，特別是在染色體外時(shí)。在穩(wěn)定的環(huán)境下，如細(xì)胞培養(yǎng)中，ecDNA通常會(huì)丟失，因此ecDNA的優(yōu)勢(shì)可能較小。因此，即使ecDNA在每個(gè)細(xì)胞周期復(fù)制一次，它也不遵循大多數(shù)有絲分裂遺傳規(guī)則，使腫瘤能夠快速進(jìn)化并保持高度的遺傳異質(zhì)性。

ecDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

染色質(zhì)組織

最近的證據(jù)表明，與染色體DNA相比，ecDNA具有增加的染色質(zhì)可及性和較不緊湊的核體組織的特點(diǎn)（圖4a）。與腫瘤樣品中的線性擴(kuò)增子相比，在染色體外環(huán)形擴(kuò)增子中觀察到轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（ATAC-seq）測(cè)定的信號(hào)更高，并對(duì)DNA拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化。在髓母細(xì)胞瘤腫瘤中證實(shí)了循環(huán)和擴(kuò)增位點(diǎn)內(nèi)ATAC-seq信號(hào)密度的增加。作者觀察到，與同源線性DNA的染色質(zhì)相比，ecDNA上的染色質(zhì)平均可接近性高出兩倍，80%的ecDNA區(qū)域高度可接近。

總的來(lái)說(shuō)，ecDNA上的基因區(qū)域比它們的線性對(duì)應(yīng)部分更容易接近。染色質(zhì)可接近性的增加導(dǎo)致ecDNA cargo基因表達(dá)水平的增加，這顯著高于基于ecDNA拷貝數(shù)的預(yù)期。驅(qū)動(dòng)ecDNA上染色質(zhì)可及性增加的機(jī)制目前尚不清楚。

增強(qiáng)子共擴(kuò)增

ecDNA的圓形結(jié)構(gòu)導(dǎo)致染色質(zhì)元素的三維重新定向，從而實(shí)現(xiàn)局部和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子-基因接觸（圖4b）。除了過(guò)去的報(bào)告表明擴(kuò)增子邊界是由DNA脆弱位點(diǎn)形成的之外，最近的研究還提供了證據(jù)，證明在癌細(xì)胞起源類型中活性的共擴(kuò)增鄰近增強(qiáng)子元件在形成擴(kuò)增子邊界中起主要作用。

在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，基于局部增強(qiáng)子的存在或不存在，描述了兩類不同的擴(kuò)增子。I類擴(kuò)增子結(jié)合了局部增強(qiáng)子元件，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，很少結(jié)合來(lái)自其他染色體的額外遠(yuǎn)端DNA片段。相比之下，II類擴(kuò)增子缺乏局部增強(qiáng)子共擴(kuò)增，但通過(guò)連接來(lái)自遠(yuǎn)處位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行補(bǔ)償。共擴(kuò)增的遠(yuǎn)距離DNA片段含有譜系特異性增強(qiáng)子元件和絕緣體，形成具有新的空間相互作用調(diào)控鄰域的高度復(fù)雜的多片段擴(kuò)增子。共擴(kuò)增調(diào)控元件及其與癌基因啟動(dòng)子的接觸不僅保留在ecDNA上，而且積極促進(jìn)癌基因表達(dá)和癌細(xì)胞適合性。

總之，ecDNA中癌基因的表達(dá)僅部分由ecDNA上癌基因劑量的增加決定。將這些新的見解整合到ecDNA驅(qū)動(dòng)的癌基因去調(diào)控的統(tǒng)一模型中，該模型將包括局部和遠(yuǎn)處增強(qiáng)子強(qiáng)度、染色質(zhì)緊密程度和可接近性、增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)處的轉(zhuǎn)錄因子親和力和DNA拷貝數(shù)之間的相互作用，這些共同決定了ecDNA的轉(zhuǎn)錄輸出。

ecDNA樞紐

在間期，細(xì)胞核在空間上被組織成一個(gè)分區(qū)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)向核內(nèi)部聚集。富含RNA聚合酶II（RNAPII）的核室充當(dāng)轉(zhuǎn)錄工廠。ecDNA的轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)可能有助于ecDNA簇的形成，并表明ecDNA利用類似原理形成核聚集體，并可能與其他ecDNA共享轉(zhuǎn)錄機(jī)制（圖5a）。

溴脫氧核糖核酸和末端外結(jié)構(gòu)域4（BRD4）蛋白積累在轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控元件上以促進(jìn)基因表達(dá)，在ecDNA中樞形成中起著重要作用。BRD4抑制是依賴于癌基因MYC的癌癥的一種治療策略，有趣的是，ecDNA陽(yáng)性細(xì)胞中BRD4的抑制導(dǎo)致了含有ecDNA的MYC和編碼其他基因的ecDNA的中樞的分散，以及減少cargo基因表達(dá)。盡管相對(duì)于線性基因組而言，單個(gè)ecDNA分子和ecDNA樞紐優(yōu)先與RNAPII相關(guān)，但在ecDNA樞紐中RNAPII分子相對(duì)更豐富，進(jìn)一步證實(shí)了ecDNA樞紐在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。RNAPII的抑制不會(huì)破壞ecDNA中樞，這表明RNAPII可能在其形成后被招募到ecDNA。

綜上所述，這些結(jié)果表明，ecDNA中樞是生物學(xué)上相關(guān)的核體，在癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，因此可能影響癌癥的維持和進(jìn)展。

反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控

ecDNA還與線性基因組物理接觸，特別是與轉(zhuǎn)錄活躍的染色體區(qū)域，這反映在ecDNA-染色體相互作用組中RNAPII和H3K27ac信號(hào)的富集上。因此，與未連接到ecDNA的區(qū)域相比，具有高ecDNA-染色體接觸頻率的區(qū)域的基因表達(dá)增加（圖5b）。因此，共擴(kuò)增ecDNA增強(qiáng)子調(diào)節(jié)同一ecDNA上癌基因的調(diào)節(jié)功能可能延伸到染色體基因，尤其是癌基因。

ecDNAs作為移動(dòng)增強(qiáng)子的這一有趣的新興功能創(chuàng)造了轉(zhuǎn)錄的合成非整倍體效應(yīng)，與整個(gè)染色體或染色體臂的拷貝數(shù)增加如何增加所有常駐基因的表達(dá)水平相當(dāng)。它還為為什么ecDNA通常包含非編碼染色體DNA提供了額外的解釋，并可能解釋了僅包含調(diào)控元件而不包含基因的ecDNA的反調(diào)控功能。此外，這種反式激活劑模型提供了一種次要但潛在重要的機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制ecDNA可以在染色體轉(zhuǎn)錄水平上快速促進(jìn)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。然而，ecDNA與特定染色體區(qū)域的親和力以及ecDNA-染色體相互作用組形成的詳細(xì)過(guò)程仍有待發(fā)現(xiàn)。

結(jié)論和展望

治療靶向的機(jī)會(huì)

許多致癌基因通過(guò)擴(kuò)增被激活，包括癌細(xì)胞中特有的外周DNA。主要的治療策略是直接抑制這些擴(kuò)增癌基因的蛋白產(chǎn)物。這種方法對(duì)于編碼蛋白激酶的癌基因尤其成功。例子包括用于治療HER2陽(yáng)性乳腺癌的抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗，以及被批準(zhǔn)用于治療攜帶EGFR擴(kuò)增的非小細(xì)胞肺癌的小分子阿法替尼。然而，大多數(shù)通過(guò)局部擴(kuò)增激活的癌基因，包括ecDNA，不是激酶。

長(zhǎng)期以來(lái)，以MYC、TERT和MCL1等頻繁擴(kuò)增的基因?yàn)榘悬c(diǎn)一直被認(rèn)為是遙不可及的。干擾ecDNA的維持、傳播、結(jié)構(gòu)或功能可提供抑制癌基因激活的機(jī)會(huì)，甚至可防止ecDNA介導(dǎo)的靶向治療耐藥性。在理想情況下，單一藥物有可能改善多種癌癥類型的預(yù)后，而不管擴(kuò)增的癌基因是什么，只要結(jié)構(gòu)是染色體外的。ecDNA的獨(dú)特特征—它們的復(fù)制、分離、聚集成中心、微核的發(fā)生和排出—提供了至少五種潛在的治療策略，如下文所述和圖6所示。

策略1：靶向ecDNA復(fù)制

DNA復(fù)制始于雙螺旋被螺旋酶解旋。有95種人類DNA螺旋酶，每種都具有DNA或RNA結(jié)構(gòu)特異性。ecDNA復(fù)制可能受到獨(dú)特的螺旋酶活性的影響，如通過(guò)特定螺旋酶進(jìn)行線粒體DNA復(fù)制。另一種選擇包括干擾脫氧核糖核酸三磷酸DNA的從頭合成，以限制核苷酸生產(chǎn)。核糖核苷酸還原酶是染色體DNA復(fù)制的限速酶，可以使用吉西他濱或羥基脲作為靶點(diǎn)。ecDNA特異性復(fù)制酶是否存在目前尚不清楚。

策略2：針對(duì)ecDNA分離

復(fù)制后，ecDNA可能在染色體DNA上分離到子細(xì)胞。目前尚不清楚是什么使ecDNA能夠附著到染色體上。更好地理解ecDNA分離可能提供了調(diào)節(jié)該過(guò)程的機(jī)會(huì)。

策略3：將ecDNA集群定位到中心

特定的ecDNA功能，如ecDNA中樞形成，可能在藥理學(xué)上受到干擾，從而降低ecDNA cargo的轉(zhuǎn)錄和活性，例如通過(guò)靶向BET蛋白BRD4。

策略4：以ecDNA為靶點(diǎn)

顯色三倍體和其他DNA斷裂事件后的DNA修復(fù)導(dǎo)致ecDNA形成。DNA損傷修復(fù)過(guò)程的擾動(dòng)，如同源重組和非同源末端連接，可能對(duì)受益于ecDNA擴(kuò)增的腫瘤不利，并可能與其他DNA損傷治療（如放療）結(jié)合最有效。

策略5：靶向ecDNA微核

最后，通過(guò)目前未知的分子機(jī)制，ecDNA比染色體DNA更容易被微核排出和消除，羥基脲也促進(jìn)了這一過(guò)程。微核化可能會(huì)阻止捕獲的ecDNA的DNA修復(fù)，從而使ecDNA容易受到電離輻射等DNA損傷策略的影響。對(duì)參與微核排出的分子途徑的深入分析可能揭示新的治療靶點(diǎn)。

治療性ecDNA靶向的挑戰(zhàn)

盡管ecDNA導(dǎo)向的藥物開發(fā)有機(jī)遇，但仍存在一些復(fù)雜因素：

首先，很明顯，它們?cè)诖笮『徒Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性等不同性質(zhì)上有所不同。這種分子異質(zhì)性可能意味著需要不同的策略來(lái)靶向ecDNA的不同亞類；

第二個(gè)潛在的復(fù)雜因素是我們關(guān)于ecDNA克隆性的數(shù)據(jù)有限。與酪氨酸激酶抑制劑類似，靶向亞克隆ecDNA可為缺乏ecDNA的細(xì)胞創(chuàng)造生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，并推動(dòng)快速克隆選擇和治療抗性；

第三，目前對(duì)ecDNAs重新整合到基因組的能力缺乏了解。整合可能隨機(jī)發(fā)生在DNA損傷部位，這提供了另一條可能限制治療效果的軌跡，因?yàn)?/span>ecDNA可能作為耐藥性機(jī)制重新整合，然后在治療取消后重新出現(xiàn)在染色體外；

最后，靶向位于細(xì)胞核中的分子需要能夠穿過(guò)多個(gè)細(xì)胞膜和內(nèi)體逃逸，從而增加了化學(xué)生物學(xué)的復(fù)雜性。填補(bǔ)這些知識(shí)空白對(duì)于最大限度地實(shí)現(xiàn)成功的抗ecDNA治療至關(guān)重要。由于多種機(jī)制可能有助于ecDNA的生成、維持和進(jìn)化，因此本綜述中討論的單一機(jī)制可能不足以成功治療攜帶癌癥的ecDNA。

此外，鑒于癌癥的異質(zhì)性，一刀切的方法可能無(wú)法奏效，ecDNA驅(qū)動(dòng)的癌癥亞類對(duì)上述治療方法的敏感性不同。然而，作者認(rèn)為降低ecDNA頻率可以降低ecDNA驅(qū)動(dòng)的治療抵抗風(fēng)險(xiǎn)，從而提高治療效果，最終延長(zhǎng)患者生存期。

見解

正如作者所指出的，人們?cè)诒碚魍庵?/span>DNA的獨(dú)特序列和染色質(zhì)組成方面取得了重要進(jìn)展。關(guān)于這些特性的許多問(wèn)題仍然沒有答案。例如，導(dǎo)致ecDNA上染色質(zhì)緊密性改變的分子機(jī)制仍然未知，ecDNA與其他ecDNA和染色體DNA的相互作用是如何形成的。未來(lái)對(duì)這些機(jī)制的研究不僅有可能揭示新的生物學(xué)特性，還可能揭示可能作為治療靶點(diǎn)的因素。

此外，使用新的單細(xì)胞方法進(jìn)行的研究有望對(duì)ecDNA細(xì)胞間異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系產(chǎn)生重要的新見解。最后，許多其他有機(jī)體，如酵母和其他有機(jī)體也含有環(huán)狀DNA，在維持、染色質(zhì)調(diào)節(jié)和復(fù)制等特性方面可能部分類似于ecDNA，這表明關(guān)于癌癥中ecDNA的一些懸而未決的問(wèn)題可能只能通過(guò)多模型系統(tǒng)中的跨學(xué)科研究方法來(lái)解決。因此，為了充分發(fā)揮ecDNA的潛力，改善ecDNA驅(qū)動(dòng)的癌癥患者的治療和診斷，需要對(duì)ecDNA相關(guān)研究進(jìn)行持續(xù)的研究。

教授介紹

Roel Verhaak博士是杰克遜基因組醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的計(jì)算生物學(xué)教授和副主任。他參與并共同領(lǐng)導(dǎo)了癌癥基因組圖譜（TCGA）的膠質(zhì)瘤項(xiàng)目，同時(shí)在哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院以及德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心工作，這項(xiàng)工作有助于提高我們對(duì)這種致命腦瘤的認(rèn)識(shí)。他是最早認(rèn)識(shí)到癌癥中染色體外DNA擴(kuò)增的頻率和潛力的人之一。Roel的研究主要集中在腦腫瘤上，主要利用對(duì)空前規(guī)模和復(fù)雜性的數(shù)據(jù)集的計(jì)算分析。Roel的研究重點(diǎn)是分析癌癥基因組數(shù)據(jù)，以提高我們對(duì)癌癥生物學(xué)的理解。他對(duì)理解腦腫瘤的疾病進(jìn)展以及研究染色體外DNA擴(kuò)增在癌癥中的作用有著專門的研究興趣。他的團(tuán)隊(duì)將功能建模的方法與大型數(shù)據(jù)集和計(jì)算方法相結(jié)合。

參考文獻(xiàn)

Yi E, Chamorro González R, Henssen AG, Verhaak RGW. Extrachromosomal DNA amplifications in cancer. Nat Rev Genet. 2022;10.1038/s41576-022-00521-5. doi:10.1038/s41576-022-00521-5

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