結(jié)直腸癌（CRC）是世界第三高發(fā)癌癥。

CRC的發(fā)生發(fā)展遵循明確的規(guī)律，即由腸息肉轉(zhuǎn)變?yōu)橄倭?，最后轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔?/p>

據(jù)統(tǒng)計，80%的CRC帶有抑癌基因APC缺失或功能喪失型突變。在腫瘤發(fā)生早期，APC突變會導致WNT通路上調(diào)以及腸上皮細胞增生。隨后，其他癌癥驅(qū)動基因激活（例如KRAS突變），或抑癌基因失活（例如TP53突變），會進一步促進腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[1]。

目前，大部分CRC的研究著重于對晚期腫瘤的分析，而且分析精度局限于腫瘤整體層面，忽略了對腫瘤早期發(fā)展過程以及腫瘤微環(huán)境的關(guān)注。因此，腸上皮細胞癌變的過程，及在此過程中組織微環(huán)境中其他組分的功能，是當前CRC領(lǐng)域亟待解決的問題。

近日，由斯坦福大學醫(yī)學院的Michael P. Snyder 和Willian J. Greenleaf領(lǐng)銜的研究團隊，在《自然·遺傳學》期刊發(fā)表了關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生過程的重要研究成果[2]。

該研究團隊收集了27個正常腸組織，48個腸息肉和6個CRC樣本。利用這些組織，研究人員在單細胞層面建立了正常腸組織→腸息肉→CRC的轉(zhuǎn)化過程中的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組圖譜。

他們不僅發(fā)現(xiàn)腸息肉和CRC組織中都存在一群新的具有干細胞表型的上皮細胞群體，還在高級別的息肉中發(fā)現(xiàn)了富集的干細胞樣上皮細胞，以及腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性Ｔ細胞（Tregs）和癌前相關(guān)成纖維細胞（preCAFs）也有所增加。

該研究第一次在單細胞層面描述了CRC癌前轉(zhuǎn)化的特征，分析了造成這些特征變化的分子機制，填補了對CRC癌前轉(zhuǎn)化的研究的缺失，并為癌前病變的分期和癌癥風險的預測提供了詳細的參考。

由于APC突變在CRC中極為普遍，而且對CRC的早期發(fā)生至關(guān)重要，因此該團隊決定利用由APC胚系突變導致的家族性腺瘤性息肉?。‵AP）作為研究模型。FAP患者的特征是其結(jié)腸內(nèi)會形成超過100枚具有不同分期和分子層面差異的腺瘤性息肉，且這些息肉大部分會發(fā)展為CRC。

為了更全面地了解腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，研究人員收集了健康人的結(jié)腸組織，F(xiàn)AP及非FAP患者的腸息肉和CRC組織。研究人員利用單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq）和單細胞染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測序（scATAC-seq），來分析和比較不同階段組織的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的差異。

研究人員首先簡單地將組織中的細胞分為上皮細胞，免疫細胞和基質(zhì)細胞。在聚集分析中，來源于不同組織的免疫細胞和基質(zhì)細胞均表現(xiàn)出明顯的聚集性。而上皮細胞則呈分散式分布，形成正常組織，息肉和CRC亞群。因此，研究人員將不同組織中的免疫細胞和基質(zhì)細胞分別作為整體進行分析，而將來源于不同組織的上皮細胞分別進行分析。

隨后，研究人員參考已知標志基因的表達狀態(tài)，對snRNA-seq數(shù)據(jù)進行注釋，同時利用標志基因的染色體活躍值（在一個基因區(qū)域的染色體可及性程度）對scATAC-seq數(shù)據(jù)進行注釋。

基于scATAC-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)了一群CRC中特有的耗竭性T細胞。這群細胞的T細胞耗竭標志基因區(qū)域有高染色體活躍值，同時在耗竭性T細胞特有的DNA基序區(qū)域（例如NR4A，RUNX，CEFB，JUN，F(xiàn)OS和BATF）也有高染色體可及性。

另外，snRNA-seq和scATAC-seq都顯示，相對于正常組織，息肉和CRC中富集調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs），而且這些Tregs在息肉到CRC轉(zhuǎn)換中持續(xù)增加，提示這些Tregs可能參與癌前轉(zhuǎn)化的免疫逃逸。與這些Tregs相反，息肉和CRC中的初始B細胞，記憶型B細胞和生發(fā)中心細胞則相對正常組織有所減少。

在對基質(zhì)細胞亞群的分析中，研究人員發(fā)現(xiàn)成纖維細胞亞群在正常組織到癌組織的轉(zhuǎn)化中也有很大變化。

首先，研究人員發(fā)現(xiàn)了一群CRC中特有的癌相關(guān)成纖維細胞（CAFs），而且這些CAFs的染色質(zhì)可及性是由轉(zhuǎn)錄因子RUNX1特異性調(diào)控的。

其次，通過對scATAC-seq數(shù)據(jù)的聚集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了另一群在息肉和CRC中都富集的成纖維細胞。這些細胞的染色質(zhì)可及性與CAFs有部分相似（例如WNT2基因區(qū)域），因此研究人員將這群成纖維細胞定義為癌前相關(guān)成纖維細胞（preCAFs）。研究人員推斷這些preCAFs可能與CAFs有相似的功能，并可能促進癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化。

研究人員還在息肉和癌組織中觀察到很多具有干細胞特性的上皮細胞，而且這些干細胞樣細胞的豐度隨著惡性轉(zhuǎn)化而上升。

基于snRNA-seq和scATAC-seq建立的細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換軌跡，研究人員發(fā)現(xiàn)在正常組織→息肉→CRC的惡性轉(zhuǎn)化中，干細胞樣上皮細胞的基因表達和染色體可及性都呈遞進式變化。與之相反，分化成熟的腸細胞在惡性轉(zhuǎn)化中則減少，其中杯狀細胞的減少尤為明顯。

因此，研究人員推斷這群具有干細胞特性的細胞可能代表了癌癥干細胞，而杯狀細胞的缺失或許也會促進腫瘤發(fā)生。

除此之外，研究人員通過表觀遺傳組學分析還發(fā)現(xiàn)，在正常組織→息肉→癌組織的轉(zhuǎn)化中，染色體發(fā)生有序的打開和關(guān)閉，同時癌癥相關(guān)基因也發(fā)生有序的上調(diào)或下調(diào)。在不同的階段，調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子的活性和特異性也有所不同。

在轉(zhuǎn)化早期，具有轉(zhuǎn)錄因子TCF和LEF結(jié)合基序的染色質(zhì)區(qū)域的可及性上調(diào)，由此可以推斷WNT通路也逐漸上調(diào)。與此同時，調(diào)控腸干細胞命運的主要基因ASCL2的基序結(jié)合區(qū)域的染色體可及性，在息肉和CRC中也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。這與研究人員觀察到的干細胞樣細胞群體的擴大相符。

具有轉(zhuǎn)錄因子HNF4A結(jié)合基序的染色質(zhì)區(qū)域的可及性則表現(xiàn)出更高的波動性，這一區(qū)域的活性在轉(zhuǎn)化早期降低，而在惡性轉(zhuǎn)化階段升高。研究人員由此推斷HNF4A在息肉和CRC中可能有不同的功能。在息肉中，HNF4A活性的降低或許使WNT通路得以被激活，而在CRC中，HNF4A可能通過驅(qū)動染色質(zhì)可及性變化來調(diào)控癌癥特異基因的表達。

最后，研究人員還觀察到，息肉中的染色質(zhì)可及性程度和CRC中的DNA甲基化程度呈高度負相關(guān)。DNA甲基化異常是導致CRC發(fā)生的一個重要因素。因此，研究人員建議，可以利用該負相關(guān)性檢測癌前病變，來找出具有惡化潛質(zhì)的息肉組織并進行移除，進而達到預防結(jié)直腸癌的發(fā)生的目的。

總的來說，這個研究在單細胞層面揭示了在CRC惡性轉(zhuǎn)化過程中染色質(zhì)可及性，基因表達，DNA甲基化以及組織中細胞組分的變化。