腫瘤基因組測(cè)序解析出BRCA1缺陷腫瘤復(fù)雜的突變模式（Mutational Signatures），主要包括特異的成簇點(diǎn)突變富集、小片段堿基增刪（InDel）、染色體易位形成，以及大量的約10 Kb的串聯(lián)倍增（Tandem Duplication，TD）；這些突變模式記錄了腫瘤形成過程中細(xì)胞遭遇的DNA損傷事件和異常修復(fù)。

根據(jù)這些特征性的突變模式開發(fā)的同源重組缺陷（Homologous Recombination Deficiency，HRD）預(yù)測(cè)工具已用于臨床預(yù)測(cè)癌癥藥物PARP抑制劑治療響應(yīng)。然而，產(chǎn)生這些特征性突變模式的主要原因和具體分子機(jī)制目前尚不明確，大大限制了人們對(duì)腫瘤基因組不穩(wěn)定性產(chǎn)生機(jī)制的理解，阻礙了以此為基礎(chǔ)的腫瘤診療策略的開發(fā)。

生理?xiàng)l件下細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性DNA損傷是基因組不穩(wěn)定性的主要元兇，其中 DNA單鏈斷裂（Single Strand Break，SSB）是最頻繁的DNA損傷，如果與DNA復(fù)制叉相遇會(huì)轉(zhuǎn)換為單末端的DNA雙鏈斷裂（Double Strand Break，DSB）。由于缺乏第二個(gè)末端，此類DSB傾向于利用同源重組（Homologous Recombination，HR）完成修復(fù)。因此，BRCA1缺陷細(xì)胞中這類DSB的異常修復(fù)是產(chǎn)生BRCA1缺陷腫瘤特異性突變模式的主要原因。但由于缺乏定點(diǎn)、有效、均一的復(fù)制偶聯(lián)的單末端DSB的誘導(dǎo)方式，針對(duì)該類型DSB的損傷應(yīng)答和修復(fù)認(rèn)知有限，BRCA1在其中的作用與機(jī)制也不清楚。

近日，浙江大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院/醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院謝安勇教授團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：DNA nicks induce mutational signatures associated with BRCA1 deficiency 的研究論文。

研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9單鏈缺刻酶（nCas9）靶點(diǎn)滯留的特點(diǎn)，在細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)高效誘導(dǎo)源于DNA單鏈缺刻的與DNA復(fù)制偶聯(lián)的單末端DSB。這類DSB，而不是雙末端DSB，在BRCA1缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)了更高頻的染色體斷裂、畸變與微核。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用一個(gè)可以區(qū)分、定量短軌基因轉(zhuǎn)換（STGC）和長(zhǎng)軌基因轉(zhuǎn)換（LTGC）的HR報(bào)告系統(tǒng)，分析BRCA1缺陷對(duì)單末端DSB的HR修復(fù)的影響。結(jié)果表明，BRCA1缺陷細(xì)胞中單末端DSB的HR修復(fù)效率下降，但LTGC偏向性卻有所提升（圖1）。

特別是，BRCA1缺陷對(duì)LTGC偏向性的推動(dòng)具有明顯的DNA復(fù)制鏈的不對(duì)稱性，即BRCA1缺陷更傾向于推動(dòng)滯后鏈崩塌相關(guān)的LTGC的偏向性，這個(gè)結(jié)果與BRCA1缺陷腫瘤中突變模式的鏈不對(duì)稱性可能有關(guān)聯(lián)。

因?yàn)閺?fù)制偶聯(lián)單末端DSB也可以利用反向會(huì)聚復(fù)制叉產(chǎn)生的第二個(gè)單末端DSB進(jìn)行NHEJ，研究者利用內(nèi)源位點(diǎn)分析了這類NHEJ效率和接口序列，發(fā)現(xiàn)BRCA1缺陷細(xì)胞中InDel頻率提高，特別是11-80bp的刪除產(chǎn)物，并伴隨微同源序列（Microhomology，MH）在接口的利用率的提高（圖1）。這個(gè)現(xiàn)象與BRCA1突變腫瘤中InDel突變特征高度一致。相反，Cas9誘導(dǎo)的雙末端DSB的NHEJ修復(fù)在BRCA1缺陷細(xì)胞中沒有產(chǎn)生這類突變模式。因?yàn)锽RCA1缺陷腫瘤中染色體易位頻率提高，研究團(tuán)隊(duì)也通過分析Cas9和nCas9誘導(dǎo)的染色體易位及BRCA1缺陷的影響，發(fā)現(xiàn)Cas9誘導(dǎo)的染色體易位頻率不因BRCA1缺陷而改變，但nCas9誘導(dǎo)的易位卻因BRCA1缺陷從無(wú)到有，甚至大量發(fā)生。這說明BRCA1缺陷腫瘤中染色體易位是源于復(fù)制偶聯(lián)的單末端DSB，而不是源于與復(fù)制無(wú)關(guān)的雙末端DSB。

10Kb左右的TD是BRCA1缺陷腫瘤備受關(guān)注的特征性突變模式。在這項(xiàng)研究中，雙末端DSB誘導(dǎo)的TD水平并不受BRCA1缺陷的影響，而單末端DSB誘導(dǎo)的TD則在BRCA1缺陷細(xì)胞中顯著富集（圖1）。有趣的是，TD頻率變化也具有明顯的鏈不對(duì)稱性，即BRCA1缺陷更傾向于推動(dòng)滯后鏈崩塌相關(guān)的TD產(chǎn)生。根據(jù)TD產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征分析和推導(dǎo)，TD形成機(jī)制包括雙輪鏈入侵（Two-Round Strand Invasion，TRIS）介導(dǎo)的和MH介導(dǎo)的TD形成（圖1）。在BRCA1野生型細(xì)胞中，Cas9和nCas9都能誘導(dǎo)MH介導(dǎo)的TD產(chǎn)物，但只有nCas9誘導(dǎo)的這類TD才會(huì)在BRCA1缺陷細(xì)胞中頻率提高，這與BRCA1缺陷腫瘤中積累相似的TD突變高度一致。

該研究不僅幫助闡明了BRCA1在雙末端DSB和復(fù)制偶聯(lián)單末端DSB修復(fù)中的功能差異，更重要的是，揭示了BRCA1缺陷腫瘤突變模式的一個(gè)主要誘因是復(fù)制偶聯(lián)單末端DSB的產(chǎn)生及修復(fù)異常，而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的雙末端DSB。這將幫助推動(dòng)腫瘤突變模式發(fā)生機(jī)制在腫瘤精準(zhǔn)診療中的臨床應(yīng)用。同時(shí)也提醒，因?yàn)榘悬c(diǎn)滯留，在分裂細(xì)胞中，我們認(rèn)為相對(duì)安全的堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的染色體畸變。

該論文通訊作者是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院和浙江大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院謝安勇教授和馮依力特聘研究員。馮依力和劉倩博士是本文第一作者。本課題得到了國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目的支持。謝安勇教授團(tuán)隊(duì)致力于腫瘤基因組不穩(wěn)定性和CRISPR基因編輯技術(shù)機(jī)制與改良的研究，已先后在 Mol Cell、Nat Struct Mol Biol、Nat Commun、Genome Biol、Nucleic Acids Res 等一系列期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文。