譚超杰1 王博1,2 鄒文奇1 任晶1 劉靜頤1 李春陽(yáng)1 白麗丹1 盛瑜11. 北華大學(xué)藥學(xué)院 2. 遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 摘要：目的 優(yōu)化中藥（北蟲(chóng)草-刺五加）抗疲勞組合物中多糖的提取工藝，并探討其體外抗氧化活性.方法 通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法優(yōu)化北蟲(chóng)草-刺五加多糖（Cordyceps militaris-Acanthopanax senticosus polysaccharide, CAP）的提取工藝；通過(guò)體外1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）清除率、總超氧陰離子自由基（total superoxide anion free radical, SAFR）清除率和羥基自由基（hydroxyl free radical）清除率比較CAP與北蟲(chóng)草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides, CMP）、刺五加多糖（Acanthopanax senticosus polysaccharide, ASPS）的抗氧化能力差異；利用H2O2誘導(dǎo)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞（PC12細(xì)胞）,構(gòu)建體外氧化損傷模型，從而考察三者體外抗氧化作用差異.結(jié)果 提取溫度90℃、提取時(shí)間3 h、料液比m（樣品，g）∶V（水，mL）=1∶40、提取次數(shù)3次為CAP的最佳提取工藝，多糖得率可達(dá)27.61%;CAP對(duì)DPPH的清除率最高可達(dá)到63.02%,對(duì)SARF的清除率最高達(dá)到67.52%,對(duì)HFR的清除率最高達(dá)到68.38%,均高于CMP和ASPS;100μg/mL的CAP可顯著提高H2O2損傷的PC12細(xì)胞的存活率，并且可以顯著提高PC12細(xì)胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase, CAT）活力，顯著降低PC12細(xì)胞中丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量，作用均高于同等濃度的CMP和ASPS.結(jié)論 該提取方法穩(wěn)定可靠，獲得的組合物多糖CAP具有明顯的體外抗氧化活性，且能夠通過(guò)減弱H2O2產(chǎn)生的活性氧而保護(hù)PC12細(xì)胞免受損傷，作用效果優(yōu)于組合物中的各味中藥多糖. 1.2 主要儀器與設(shè)備1.3 試驗(yàn)條件1.3.1 北蟲(chóng)草-刺五加多糖的提取1.3.2 單因素試驗(yàn)
1.3.3 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)見(jiàn)表2.
1.3.4 最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)正交試驗(yàn)中所得到的優(yōu)化條件展開(kāi)了3次平行試驗(yàn)，并以此檢驗(yàn)該方案的可行性. 1.3.5 多糖體外抗氧化活性研究北蟲(chóng)草-刺五加粗多糖、北蟲(chóng)草粗多糖、刺五加粗多糖經(jīng)除蛋白、透析后，獲得精制的CAP、CMP、ASPS多糖，得率分別為27.61%、21.43%、4.42%. DPPH清除率測(cè)定：精密稱取一定量的各組多糖粉末，加蒸餾水使其溶解，配制成不同濃度的儲(chǔ)備液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL),各取1.0 mL溶液于試管中，參照文獻(xiàn) 超氧陰離子清除率測(cè)定：精密稱取一定量的各組多糖粉末，加蒸餾水使其溶解，配制成不同濃度的儲(chǔ)備液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL),各取1.0 mL溶液于試管中，按參照文獻(xiàn) 羥基自由基消除率測(cè)定：精密稱取一定量的各組多糖粉末，加蒸餾水使溶解，配制成質(zhì)量濃度為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL的儲(chǔ)備液，各取1.0 mL溶液于試管中，參照文獻(xiàn) 1.3.6 多糖對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞存活率的影響多糖樣品處理：將CAP、CMP、ASPS用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成濃度為200 μg/mL的溶液，備用. 試驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、正常對(duì)照組 (10%小牛血清培養(yǎng)液)、損傷組、損傷組+200 μg/mL CAP組、損傷組+200 μg/mL CMP組、損傷組+200 μg/mL ASPS組. 在96孔板中以5×104個(gè)/孔的濃度接種PC12細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜(37 ℃).損傷組和多糖樣品+損傷組每孔加入300 μmol/L H2O2溶液100 μL,處理4 h進(jìn)行造模，CAP、CMP、ASPS模型組各加100 μL的多糖溶液，正常對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，輕搖混勻后放入孵箱中孵育48 h, 參照文獻(xiàn) 1.3.7 PC12細(xì)胞中SOD、CAT、MDA 的測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)1.3.6細(xì)胞造模條件得到的結(jié)果選取細(xì)胞，經(jīng)藥物作用48 h后，收集細(xì)胞并將其超聲破碎，在4 ℃條件下，3 000 r/min離心10 min, 收集上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活力和MDA含量. 2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖1看出，提取液中多糖的得率隨著溫度的上升而提高，繼續(xù)提高溫度，多糖得率不再上升，可能是高溫導(dǎo)致部分多糖水解失活，故選擇90 ℃作為最佳提取參數(shù)；提取時(shí)間在3～4 h范圍內(nèi)，多糖得率呈上升趨勢(shì)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)多糖得率不再提高，考慮到提取成本，故選擇提取時(shí)間4 h作為最佳提取參數(shù)；當(dāng)液料比m(樣品，g)∶V(水，mL)從1∶10增加到1∶30時(shí)，北蟲(chóng)草-刺五加多糖的得率逐漸上升，在料液比m(樣品，g)∶V(水，mL)1∶30時(shí)多糖得率達(dá)到最高，之后多糖得率不再隨著料液比的增加而上升，考慮到提取成本，故選擇料液比m(樣品，g)∶V(水，mL)1∶30作為最佳提取參數(shù)；當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，北蟲(chóng)草-刺五加組合物的多糖得率最高，故選擇重復(fù)提取3次作為最佳提取參數(shù).
圖1 北蟲(chóng)草-刺五加多糖不同提取因素對(duì)得率的影響 2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，因素A(提取溫度)中k2>k3>k1,因素B(提取時(shí)間)中k2>k3>k1,因素C(料液比)中k3>k2>k1,因素D(提取次數(shù))中k2>k3>k1,但R值顯示因素D>B>C>A,故各因素對(duì)北蟲(chóng)草-刺五加組合物的粗多糖得率的影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>提取時(shí)間>料液比>提取溫度.因此，最終選用A2B2C3D2為最佳提取條件，即提取溫度90 ℃,提取時(shí)間3 h, 料液比m(樣品，g)∶V(水，mL)=1∶40,提取次數(shù)3次，結(jié)果為提取時(shí)間>提取溫度>料液比.
2.3 北蟲(chóng)草-刺五加多糖提取最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)在正交試驗(yàn)所最終確定組合物多糖的最佳水提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的多糖平均得率為27.61%,接近于驗(yàn)證試驗(yàn)中最高得率(28.28%),且重復(fù)性較好，進(jìn)一步確定了提取CMP的最佳提取工藝為提取溫度90 ℃,提取時(shí)間3 h, 料液比m(樣品，g)∶V(水，mL)=1∶30,提取次數(shù)3次.
2.4 多糖抗氧化結(jié)果2.4.1 DPPH清除率測(cè)定從圖3看出，CAP、CMP和ASPS對(duì)DPPH的清除效果隨著濃度的增加而增加，其中CAP的效果最好，盡管低于抗壞血酸，但清除率最高可達(dá)到63.02%. 2.4.2 SAFR清除率測(cè)定由圖4看出，CAP、CMP和ASPS對(duì)SAFR的清除率隨溶液濃度的升高而增大，其中CAP的效果最好，最高達(dá)到67.52%.
圖3 CAP、CMP、ASPS和抗壞血酸對(duì)SAFR清除率
圖4 CAP、CMP、ASPS和抗壞血酸對(duì)羥基自由基清除率 2.4.3 羥基自由基清除率測(cè)定由圖5看出，CAP、CMP、ASPS對(duì)羥基自由基的清除率隨溶液濃度的升高而增大，其中CAP對(duì)羥基自由基的清除率明顯高于CMP和ASPS. 2.5 各組多糖體外細(xì)胞抗氧化結(jié)果2.5.1 各組多糖對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞活力的影響由圖5可見(jiàn)，與正常組細(xì)胞比較，H2O2作用后的PC12細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01),給藥(多糖CAP、CMP、ASPS)后細(xì)胞的增殖活性均有提高，其中CAP的上升趨勢(shì)最顯著 (P<0.01),給藥組細(xì)胞的增殖活性均有提高，其中CAP的上升趨勢(shì)最顯著 (P<0.01).
圖5 各組多糖對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞活力的影響 2.5.2 各組多糖對(duì)PC12細(xì)胞SOD、CAT活力和MDA含量的影響由圖 6、圖7可見(jiàn)：與空白組比較，模型組H2O2誘導(dǎo)氧化損傷PC12細(xì)胞中SOD活力、CAT活力顯著降低，說(shuō)明模型建立成功(P<0.01).經(jīng)CAP處理后，該治療組PC12細(xì)胞中SOD活力、CAT活力顯著提高(P<0.01).
圖6 各組多糖對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞SOD 活力的影響
圖7 各組多糖對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞CAT 活力的影響
圖8 各組多糖對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞MDA 活力的影響 |
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