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導(dǎo) 語：今天的問診案例，涉及到兩個常見詞匯：S/P值和Ct值。你可能常聽到S/P值越高，抗體濃度越高。Ct值越低，感染某某豬病的可能性越高。但你是否懂其中的原理？先解決概念問題。 什么是Ct值？ 想要知道Ct值，先要了解PCR。PCR，聚合酶鏈式反應(yīng)，DNA聚合酶介導(dǎo)的合成DNA鏈的反應(yīng)。是對目標DNA片段進行擴增（大量的翻倍復(fù)制）的方法。 為什么對DNA進行擴增？因為通常情況下病毒DNA的含量太低了，即使是經(jīng)過了提純，仍然沒辦法直接測量有無和多少，所以需要通過PCR技術(shù)擴增。以目標DNA為模板，對這段DNA進行復(fù)制粘貼，使這段DNA能夠檢測到的量，甚至達到可以用肉眼看的到的量。 擴增一次需要一個特定流程，即通過高溫使一個雙鏈DNA拆成兩個單鏈，然后降溫到聚合酶的活性溫度，聚合酶以兩個單鏈DNA作為模板，生成兩個新的雙鏈DNA，即實現(xiàn)了對原來DNA片段的“克隆”。所以PCR儀本質(zhì)是一個溫控設(shè)備，而其中用到的聚合酶當(dāng)然也必須是可以耐高溫的聚合酶。 如何確定要復(fù)制哪一段DNA，這時候就需要使用引物（與目標DNA序列互補的一個短片段）來開個頭，引導(dǎo)后續(xù)的合成，這樣就確保只對目標DNA序列進行擴增。 通過一次這樣的程序，1個目標DNA片段變成了2個。而之后的流程則是重復(fù)這個程序，所以一個這樣的程序稱為一個循環(huán)（Circle）。原理上，如果只有1個目標DNA片段，經(jīng)過1次循環(huán)獲得2個同樣的DNA片段，如果經(jīng)過5次循環(huán)得到2^5個同樣的DNA片段即32個，如果40個循環(huán)得到2^40次方個這個DNA片段，即1,099,511,627,776個。當(dāng)然如果原始樣本里沒有目標DNA，0^40次方仍然是0。 當(dāng)然，這里有個前提，就是必須有足夠量的合成原料，即引物和游離核苷酸。所以PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段與細菌增值曲線類似，前期指數(shù)增長，后期原料耗盡則曲線拉平。 Ct值 在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，通過一定的技術(shù)設(shè)計，可以實現(xiàn)對合成的DNA的數(shù)量進行實時定量檢測，也就是實時定量PCR技術(shù)，qPCR。 而測量的方法則一般是通過檢測熒光信號的強度來實現(xiàn)，比如可以在反應(yīng)體系中加入熒光染料（方法之一），這種染料特異性的摻入DNA鏈之后就會發(fā)出熒光。制造出的目標DNA片段數(shù)量越多，則發(fā)出的熒光越強。 當(dāng)原始樣本中目標DNA的越多，達到這個臨界值所需要的循環(huán)次數(shù)越小，所以Ct值越小意味著，原始樣本中這種DNA的濃度就越高，對于非瘟檢測來說，就是感染越嚴重。 通常實時定量PCR跑40個擴增循環(huán)，如果Ct值小于29被認為是強陽性，如果Ct值在30-37之間認為是陽性，Ct值在38-40則可能是含有最小量的目標DNA，也可能是環(huán)境污染。 什么是S/P值？ 簡單的說，S/P值是酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）的一種結(jié)果形式。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）  先在反應(yīng)容器的表面（微孔板）附著上需要檢測的抗體的特異性抗原，用來捕獲受測樣本中的抗體。把受測樣本注入微孔后，樣本中的抗體就會被之前加入的抗原捕獲在容器表面。 沖洗掉其他東西，剩下的就是沒用完的抗原和捕獲了抗體的抗原。這個時候當(dāng)然不能直接去數(shù)有多少個抗體，因為抗體太小了，是一個很弱的檢測信號，需要把這個信號放大。而酶就是那個信號放大器。 把酶連接在所測抗體的抗體上（抗抗體）構(gòu)成酶標抗體，把酶標抗體加入剛才的反應(yīng)容器，同樣的原理，酶標抗體會被抗體捕獲。沒被捕獲的酶標抗體會被沖洗掉。這個時候再加入顯色液，顯色液在酶的作用下變色，被捕獲的酶標抗體越多，顏色越深。通過這種方法間接的實現(xiàn)了對抗體的有無和多少進行了顯示。 此時可以用肉眼直接觀察，但是如果要精確測量就需要用到一個比色計（酶標儀）。比色計的原理是向樣品孔中照射特定波長的光，測量有多少光被吸收，就能得到每個樣品孔的吸光度的值。 吸光度值與抗體濃度存在一一對應(yīng)的關(guān)系，因此只需要找到這個關(guān)系就可以把吸光度值轉(zhuǎn)化成抗體的濃度值。 一種方法是，把陽性標準品做梯度稀釋，然后把不同稀釋濃度的吸光度值做一個標準曲線，然后拿樣品的吸光度值去曲線上比對，就能夠獲得樣品中抗體的濃度數(shù)值。 當(dāng)然還有更簡便的方法，即不做梯度稀釋，直接用樣品的吸光度值跟特定濃度的標準品吸光度值進行比對。這也就是S/P值方法。
S/P值是一個比值。即S——Sample樣本的吸光度值，比，P——Positive陽性對照的吸光度值。完整公式是： S/P = (樣本值-陰性對照值)/（陽性對照值-陰性對照值) 所以如果S/P≥1 時，當(dāng)然肯定是陽性，說明樣本中抗體的濃度等于或超過了陽性對照的濃度。S/P的值越大，抗體濃度越高。 如果S/P<1，會稍微復(fù)雜一些，小于1說明樣品中的抗體量小于陽性對照的量，但是少多少才是陰性？所以這個時候就需要用一個分界值來判定。這個分界值，一般需要廠家測量之后根據(jù)敏感度和特異度進行制定，比如有的廠家藍耳病抗體的臨界值設(shè)置為0.4，也就是當(dāng)S/P<0.4 則可以判定為陰性，如果S/P>0.4則判定為陽性。 再回到我們今天的問診案例。 問診案例一：養(yǎng)豬人：藍耳滅活苗與藍耳活疫苗的免疫S/P值看法一樣嗎？藍耳檢測S/P值是否越大越好？假如免疫藍耳滅活苗，S/P的數(shù)值在多少范圍內(nèi)合理？曹海濤：你好，目前實驗室檢測絕大多數(shù)都是ELISA試劑盒，它目的蛋白是病毒蛋白的N蛋白，不是中和抗體，所以代表不了中和抗體水平，更不能完全表示中和病毒能力。 我們主要是看豬群的抗體趨勢，綜合陽性率、離散度、整齊度，再結(jié)合臨床癥狀，生產(chǎn)成績，一起判斷疾病的感染規(guī)律。無論滅活苗和活苗，都能干擾抗體的變化，請結(jié)合上述情況，綜合判斷，才能更趨近于真實。 養(yǎng)豬人：那藍耳監(jiān)測S/P的數(shù)值代表什么？離散度高能說明什么問題？S/P值陰性代表什么？S/P陽性代表什么？S/P在1以下，在1到2之間，在2以上，各能說明什么問題？ S/P值超過3能說明什么問題？豬群是不是就不好養(yǎng)了？ 曹海濤：S/P值是檢測的計算結(jié)果，一般需要陽性對照和陰性對照，S/P值=（樣品值-陰性對照平均值）/（陽性對照平均值-陰性對照平均值）。一般S/P值大于0.4為陽性，表示曾經(jīng)感染過野毒或接種過疫苗有抗體；小于0.4為陰性，沒有抗體保護，陰性暴露，易感染。 這個抗體是用檢測N蛋白的數(shù)量而表示的，但不代表中和抗體水平。所以我們需要看整體樣本是什么豬，哪個階段的，再看S/P值的分布，再分析。一般我們經(jīng)驗認為數(shù)值大于3.5以上，急性感染；2.5～3.5之間，說明病毒血癥幾率高；1.0～2.0，穩(wěn)定群；0.7～1.8，理想群。所以，不能單獨看一個或一組數(shù)據(jù)分析，最好有采樣合理分布，和近期3月內(nèi)其他檢測數(shù)據(jù)，相互結(jié)合分析。其實數(shù)值大小，和實驗室、試劑盒、豬群本身、疫苗、野毒等都有直接相關(guān)性。離散度=本組數(shù)值的標準差/本組平均值*100%，離散度高，說明整齊度差，感染風(fēng)險高。 我們采樣的置信度很關(guān)鍵，采樣分布直接決定結(jié)果是否能真實反應(yīng)檢測結(jié)果。而且不能單獨看一個值或一組值，一定要看趨勢。比如母豬個別2.5，符合正態(tài)分布，也可能是穩(wěn)定群；再比如保育豬1.8，也可能病毒血癥，易繼發(fā)細菌感染。如果群體大于3，可能感染野毒，處在病毒血癥階段。 問診案例二：養(yǎng)豬人：老師好，產(chǎn)房仔豬睪丸液監(jiān)測藍耳抗原陽性，Ct值34。場內(nèi)豬群未有臨床癥狀母豬群也沒有病毒血癥，但最近一個月流產(chǎn)指標上升百分之一。這種情況可以正常的進行藍耳疫苗的普免嗎？苑麟勇：您好，產(chǎn)房仔豬睪丸組織液藍耳病抗原陽性，說明母豬在排毒或母豬群藍耳病野毒活躍，這時建議母豬加強一次藍耳病疫苗，普免前后加強保健！ 養(yǎng)豬人：我們正常是1月份進行普免，一年4次。監(jiān)測到抗原，我是想問一下是先保健一下再進行免疫，還是免疫與保健同時進行？ 苑麟勇：建議免疫前后、免疫時可以同時保??！ |
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