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在基因治療靶點發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)的過程中，如何將基因片段高效、精準地遞送到目的組織器官中，且不引起機體免疫、脫靶效應(yīng)等副作用，是目前需要攻克的一大技術(shù)難點?？蒲腥藛T經(jīng)過開展大量的研究后，形成了兩大類遞送系統(tǒng)：病毒載體和非病毒載體。其中rAAV病毒載體是現(xiàn)今最常用、被認為最有應(yīng)用前景的遞送載體。這是由于rAAV具有免疫原性低、靶向性強、宿主范圍廣、可長期穩(wěn)定地表達外源基因、安全性高和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點。因此，rAAV常用于體內(nèi)基因操作實驗。 以rAAV作為遞送系統(tǒng)，開展一次成功的體內(nèi)基因操作實驗并不容易。因為rAAV血清型的選擇、載體設(shè)計、rAAV的生產(chǎn)質(zhì)量、注射方式、劑量的選擇和實驗操作等因素決定了實驗的成功與否。下面與大家一同回顧rAAV體內(nèi)基因操作實驗的關(guān)鍵細節(jié)。 一、血清型與啟動子選擇是前期實驗方案設(shè)計中的關(guān)鍵 為了實現(xiàn)目的基因在特定的組織中高效表達，需要前期做好實驗規(guī)劃。其中最為關(guān)鍵的是需要選擇合適的血清型和啟動子。由于rAAV的吸附，入侵，胞內(nèi)運輸，蛋白酶體降解，入核，脫衣殼等步驟都與衣殼蛋白相關(guān)，因此血清型的結(jié)構(gòu)決定rAAV的侵染效率和靶向特異性等基本能力。我們可以根據(jù)實驗需求選擇合適的血清型。下表是由小編整理的常見血清型的組織靶向性總結(jié)，供大家參考。
特異性啟動子能使目的基因在特定的組織和細胞類型中表達，因此我們可以選用特異性啟動子，進一步提高目的基因遞送的特異性?？梢赃x用一些被改造的特異性啟動子，如融合了增強子序列的特異性啟動子，這些特異性啟動子往往在保證組織特異性的同時也具備較高的啟動活性。同時盡量選用較短長度的啟動子，以此擴大目的基因的裝載容量。下表是由小編整理的常見特異性啟動子及其靶向性總結(jié)，供大家參考。  二、專業(yè)的實驗操作對注射效果有重要影響 選擇合適和血清型和設(shè)計合適的載體只是實驗成功的基本前提，而注射方式、注射劑量和實驗操作等，這些因素也對我們實驗的成敗有著重要的影響。 在注射方式上，分為系統(tǒng)性注射和局部注射。系統(tǒng)性注射又包括尾靜脈注射、腹腔靜脈注射、眼眶靜脈注射和頸靜脈等。局部注射方式常見的包括腦立體定位注射、肌肉定點注射、心肌原位注射、玻璃體腔內(nèi)注射、關(guān)節(jié)腔注射等。系統(tǒng)性注射操作簡單，但由于需要依賴病毒在體內(nèi)隨機擴散到達靶組織，因此其病毒用量較大。局部注射所需的病毒量較少，一般100ul以內(nèi)，但對滴度要求較高。由于是直接將rAAV注射到目標組織中，因而局部注射會有更好的靶向性。我們可以根據(jù)實際的需求來選擇合適的注射方式，下表是小編整理的針對常見注射部位的有效注射方法，供大家參考。
在實際操作過程中，我們需要詳細了解操作步驟和注意細節(jié)。特別是一些具有難度的局部注射的方法，這些方法往往涉及開腹、尋找微組織等操作，對實驗條件和操作手法要求較高，稍有失誤，小鼠便會有較大的損傷，最終影響實驗結(jié)果。下面給大家介紹幾個注射方式的難點及注意細節(jié)。 01.乳鼠顳靜脈注射 1體積?。?/strong>剛出生的乳鼠體重僅有1g左右； 2血管細：顳靜脈細如一根線，分布在耳前深部，若隱若現(xiàn)； 3麻醉難：新生乳鼠無法通過麻醉藥物麻醉，需冰凍麻醉，冰凍時間過短無法麻醉，冰凍時間過長乳鼠會死亡； 4護理難：乳鼠注射后需及時保溫，同時母鼠有可能因為乳鼠的氣味變化，出現(xiàn)不哺育甚至吃掉幼崽。  圖1. 乳鼠顳靜脈注射 02.腦立體定位注射 1坐標變化大：大小鼠成年前腦部不斷發(fā)育，腦區(qū)坐標也在不斷變化； 2注射位點多：腦部可注射的位點包括海馬體、側(cè)腦室、第三腦室、紋狀體等，即使注射同一區(qū)域坐標也不固定； 3體位固定難：大小鼠通過鼻夾、耳棒等工具保定頭部，還需進行多次調(diào)平方可開始定坐標； 4顱骨鉆孔難：需用專門的顱鉆及適配的鉆頭對顱骨進行打孔，打孔轉(zhuǎn)速過低難以鉆穿顱骨，轉(zhuǎn)速過高會鉆穿腦膜，導(dǎo)致腦部出血。  圖2. 腦立體定位注射 03.肝門靜脈注射 1操作復(fù)雜：需進行腹部手術(shù)，將腸道移出腹腔，肝臟及胰腺易損，動作輕柔，找到肝門靜脈； 2易滲血：肝門靜脈較大且充盈，穿刺血管給藥容易導(dǎo)致血管不可逆的損傷，出現(xiàn)持續(xù)性滲血或爆發(fā)性出血，降低存活率。 3護理難：術(shù)中存在感染風(fēng)險，術(shù)后需注射抗生素，并保溫至動物蘇醒。 04.氣管內(nèi)注射 1無創(chuàng)插管難：經(jīng)口腔插入小鼠氣管需有一定的技巧性，插管失敗易導(dǎo)致喉頭腫脹或誤插食管； 2有創(chuàng)注射損傷大：暴露氣管需頸部開口，導(dǎo)致氣管上方肌肉撕裂，鋼針刺入也會導(dǎo)致氣管損傷、小鼠呼吸不暢。 05.尾靜脈注射 尾靜脈注射失敗易導(dǎo)致病毒在尾部殘留，影響整體病毒注射量和成像結(jié)果（如圖3第4只小鼠）。  圖3. 尾靜脈注射 三、結(jié)語 一次成功的rAAV體內(nèi)的基因操作實驗，需要考慮多方面的因素。前期需要查閱大量的資料選擇血清型和啟動子，設(shè)計合理科學(xué)的方案，并生產(chǎn)出高滴度高感染效率的rAAV。此外擁有熟練的實驗操作技能和專業(yè)素養(yǎng)，才能有效地將rAAV遞送至體內(nèi)，從而有效實現(xiàn)目的片段的表達。 |
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