無論你在做什么，無論是開車、慢跑，還是最懶的時(shí)候，在沙發(fā)上吃薯片、看電視，你的每個(gè)細(xì)胞里都有一套完整的分子機(jī)器在努力工作。這些機(jī)器太小了，用肉眼甚至用許多顯微鏡都看不到，它們?yōu)榧?xì)胞創(chuàng)造能量，制造蛋白，復(fù)制DNA，等等。

在這些機(jī)器中，最復(fù)雜的一種是核孔復(fù)合體（nuclear pore complex, NPC）。NPC由1000多個(gè)蛋白組成，是細(xì)胞核中極具辨別能力的守門人，而細(xì)胞核是細(xì)胞內(nèi)的膜包圍區(qū)域，保存著細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。任何進(jìn)出細(xì)胞核的東西都必須經(jīng)過NPC。

NPC扮演著細(xì)胞核守門人的角色，這意味著它對細(xì)胞的運(yùn)作至關(guān)重要。在細(xì)胞核內(nèi)，作為細(xì)胞的永久遺傳密碼，DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生RNA。然后RNA被帶出細(xì)胞核，以便用于制造細(xì)胞所需的蛋白。NPC確保細(xì)胞核獲得合成RNA所需的材料，同時(shí)也保護(hù)DNA不受細(xì)胞核外惡劣環(huán)境的影響，并使RNA在產(chǎn)生后離開細(xì)胞核。

加州理工學(xué)院化學(xué)與生物化學(xué)教授André Hoelz說，“這有點(diǎn)像一個(gè)可以維修747飛機(jī)的機(jī)庫，門打開讓747飛機(jī)進(jìn)來，但是有一個(gè)人站在那里，可以在門打開的時(shí)候不讓玻璃顆彈珠出去?！倍嗄陙恚琀oelz一直在研究和破譯NPC的結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系。多年來，他一直在穩(wěn)步地揭開它的秘密，一點(diǎn)一點(diǎn)地揭開它們。

這類研究的影響可能是巨大的。NPC不僅是細(xì)胞運(yùn)作的核心，而且還涉及許多疾病。NPC突變導(dǎo)致一些無法治愈的癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）和急性壞死性腦病，以及包括心房顫動和早期心臟猝死在內(nèi)的心臟疾病。此外，許多病毒，包括造成COVID-19的冠狀病毒SARS-CoV-2，在它們的生命周期中靶向并關(guān)閉NPC。

如今，在兩項(xiàng)新的研究中，Hoelz和他的研究團(tuán)隊(duì)描述了兩項(xiàng)重要的突破：確定了NPC的外表面結(jié)構(gòu)，并闡明了特殊蛋白質(zhì)像分子膠一樣將NPC固定在一起的機(jī)制。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2022年6月10日的Science期刊上，論文標(biāo)題分別為“Architecture of the cytoplasmic face of the nuclear pore”和“Architecture of the linker-scaffold in the nuclear pore”。

非常微小的三維拼圖

在第一項(xiàng)新的研究中，Hoelz團(tuán)隊(duì)描述了他們?nèi)绾卫L制出NPC從細(xì)胞核向外延伸到細(xì)胞質(zhì)的這一側(cè)的結(jié)構(gòu)。為了做到這一點(diǎn)，他們必須針對每個(gè)拼圖塊使用電子顯微鏡和X射線結(jié)晶學(xué)等成像技術(shù)，拼出相當(dāng)于一個(gè)非常小的三維拼圖。

論文共同第一作者、加州理工學(xué)院生物化學(xué)與分子生物物理學(xué)研究生Stefan Petrovic說，這個(gè)過程從經(jīng)過基因改造后產(chǎn)生構(gòu)建人類NPC的蛋白的大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)室中常用的一種細(xì)菌菌株）開始。

Petrovic說，“如果你走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，你可以看到燒瓶里面的培養(yǎng)物正在生長。我們在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)每種蛋白，裂解這些細(xì)胞，并對每種蛋白成分進(jìn)行化學(xué)純化。”

一旦純化---這可能需要多達(dá)1500升的細(xì)菌培養(yǎng)物以獲得足夠的材料用于單一實(shí)驗(yàn)---完成后，Hoelz團(tuán)隊(duì)開始艱苦地測試NPC的各個(gè)蛋白成分如何結(jié)合在一起。

論文共同第一作者、加州理工學(xué)院化學(xué)博士后高級研究助理George Mobbs說，NPC組裝是以“逐步”的方式進(jìn)行的；這些作者不是同時(shí)將所有的蛋白倒入一個(gè)試管，而是測試成對的蛋白，看看哪些蛋白會像兩個(gè)拼圖塊一樣結(jié)合在一起。如果找到了一對結(jié)合在一起的蛋白，他們就會用這兩個(gè)現(xiàn)在結(jié)合在一起的蛋白與第三個(gè)蛋白進(jìn)行測試，直到他們找到一個(gè)與這對蛋白結(jié)合在一起的蛋白，然后用產(chǎn)生的三個(gè)結(jié)合在一起的蛋白與其他蛋白進(jìn)行測試，以此類推。他們以這種方式研究這些蛋白，最終產(chǎn)生了他們的這篇論文中的最終結(jié)果：一個(gè)由16個(gè)蛋白組成的楔子，像比披薩片一樣重復(fù)了8次，形成了NPC面向細(xì)胞質(zhì)的外表面。

人類核孔復(fù)合體的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，圖片來自Science, 2022, doi:10.1126/science.abm9129。

論文共同第一作者、加州理工學(xué)院化學(xué)博士后副研究員Si Nie說，“我們報(bào)告了人類NPC整個(gè)細(xì)胞質(zhì)面的第一個(gè)完整結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行了嚴(yán)格的驗(yàn)證，而不是報(bào)告一系列基于部分、不完整或低分辨率觀察的片段或部分的漸進(jìn)進(jìn)展。我們決定耐心等待，直到我們獲得所有必要的數(shù)據(jù)，報(bào)告了大量的新信息?！?/p>

他們的研究補(bǔ)充了德國馬克斯-普朗克生物物理研究所的Martin Beck開展的研究，Beck及其研究團(tuán)隊(duì)使用低溫電子斷層掃描技術(shù)生成了一個(gè)提供這個(gè)三維拼圖的輪廓的圖片，而Hoelz團(tuán)隊(duì)必須將這些拼圖塊放到這個(gè)三維拼圖中。為了加速完成人類NPC結(jié)構(gòu)的拼圖，Hoelz和Beck在兩年多前交換了數(shù)據(jù)，然后獨(dú)立構(gòu)建了整個(gè)NPC的結(jié)構(gòu)。Hoelz說，“經(jīng)過大幅改進(jìn)的Beck圖片更清楚地顯示了我們確定了原子結(jié)構(gòu)的NPC的每個(gè)拼圖塊的放置位置，這就像確定了一個(gè)拼圖塊邊緣的木框?！?/p>

Hoelz小組通過實(shí)驗(yàn)確定的NPC拼圖塊（即NPC的蛋白成分）的結(jié)構(gòu)有助于驗(yàn)證Beck團(tuán)隊(duì)的建模工作。Petrovic說，“我們使用不同的方法獨(dú)立地將每個(gè)NPC拼圖塊的結(jié)構(gòu)放入這個(gè)三維拼圖中，但最后的結(jié)果完全一致。看到這一點(diǎn)是非常令人滿意的?！?/p>

論文共同第一作者、加州理工學(xué)院化學(xué)高級博士后研究助理Christopher Bley說，“我們建立了一個(gè)框架，現(xiàn)在可以在這個(gè)框架上做很多實(shí)驗(yàn)。我們現(xiàn)在有了這種復(fù)合結(jié)構(gòu)，它使未來關(guān)于NPC功能甚至疾病的實(shí)驗(yàn)成為可能并為之提供信息。NPC中有很多突變與可怕的疾病有關(guān)，知道它們在結(jié)構(gòu)中的位置以及它們?nèi)绾尉奂谝黄?，可以幫助設(shè)計(jì)下一組實(shí)驗(yàn)，試圖回答這些突變所起何種作用的問題。”

“優(yōu)雅的意大利面條排列方式”

在第二項(xiàng)新的研究中，Hoelz團(tuán)隊(duì)描述了他們?nèi)绾未_定NPC的連接-支架（linker-scaffold）的整個(gè)結(jié)構(gòu)。NPC的蛋白成分分為支架型核孔蛋白（nucleoporin, Nup）和連接型Nup，它們將幫助將NPC固定在一起，同時(shí)也為它提供了開啟和關(guān)閉以及調(diào)整自身以適應(yīng)通過的分子所需的靈活性。

Hoelz將NPC比作由樂高積木搭建而成的東西，這些積木組裝在一起，但沒有鎖在一起，而是被橡皮筋綁在一起，使它們大部分保持在原位，同時(shí)仍然允許它們有一點(diǎn)移動。

Hoelz說，“我把這些非結(jié)構(gòu)化的膠塊稱為'核孔的暗物質(zhì)’。這種優(yōu)雅的意大利面條排列將一切都保持在一起。”

這種表征NPC連接-支架結(jié)構(gòu)的過程與表征NPC其他部分的過程基本相同。Hoelz團(tuán)隊(duì)制造并純化了大量的多種類型的連接型Nup和支架型Nup，使用各種生化實(shí)驗(yàn)和成像技術(shù)來檢查不同種蛋白之間的相互作用，并逐個(gè)測試它們，看它們在完整的NPC中是如何組裝在一起的。

為了驗(yàn)證他們的研究，他們將突變引入編碼活細(xì)胞中每個(gè)編碼連接型Nup的基因中。由于他們知道這些突變將如何改變特定連接型Nup的化學(xué)性質(zhì)和形狀，使其具有缺陷，他們可以預(yù)測當(dāng)這些有缺陷的蛋白被引入時(shí)，細(xì)胞的NPC結(jié)構(gòu)會發(fā)生什么。如果細(xì)胞的NPC在功能和結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)了他們預(yù)期的缺陷，他們就知道他們有正確的連接型Nup排列。

Petrovic說，“細(xì)胞比我們在試管中創(chuàng)建的簡單系統(tǒng)要復(fù)雜得多，因此有必要驗(yàn)證從體外實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果在體內(nèi)是否成立。”

NPC外表面的組裝也幫助解決了一個(gè)關(guān)于核膜---環(huán)繞細(xì)胞核的雙膜系統(tǒng)---的長期之謎。與細(xì)胞膜一樣，核膜也不是完全光滑的。相反，它布滿了稱為膜內(nèi)在蛋白（integral membrane protein, IMP）的分子，這些分子發(fā)揮著各種作用，包括充當(dāng)受體和幫助催化生化反應(yīng)。

盡管IMP在核膜的內(nèi)側(cè)和外側(cè)都能找到，但人們一直不清楚它們實(shí)際上如何從一側(cè)移動到另一側(cè)。事實(shí)上，由于IMP鑲嵌在核膜的內(nèi)部，它們不能像自由漂浮的分子那樣滑行通過NPC的中央運(yùn)輸通道。

一旦Hoelz團(tuán)隊(duì)理解了NPC的連接-支架結(jié)構(gòu)，他們意識到它允許在它的外緣形成小的“溝渠”，使IMP能夠從核膜的一側(cè)滑過NPC到核膜的另一側(cè)，同時(shí)始終保持本身嵌入核膜中。

Hoelz說說，“我很高興地看到，正如我們十多年前最初提出的那樣，NPC的中央傳輸通道確實(shí)有能力為這些IMP擴(kuò)張并形成側(cè)門?！?/p>

總的來說，這兩篇論文的發(fā)現(xiàn)代表了科學(xué)家們對人類NPC如何構(gòu)建以及如何發(fā)揮作用的理解有了飛躍。Hoelz團(tuán)隊(duì)的發(fā)現(xiàn)為更多的研究打開了大門。Hoelz說，“在確定了它的結(jié)構(gòu)之后，我們現(xiàn)在可以專注于研究NPC功能的分子基礎(chǔ)，例如mRNA如何從細(xì)胞核輸出以及許多NPC相關(guān)疾病的根本原因，目的是開發(fā)新的療法?！保?a >生物谷 Bioon.com）

參考資料：

Christopher J. Bley et al. Architecture of the cytoplasmic face of the nuclear pore. Science, 2022, doi:10.1126/science.abm9129.

Stefan Petrovic et al. Architecture of the linker-scaffold in the nuclear pore. Science, 2022, doi:10.1126/science.abm9798.