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Cell：單細胞組學技術揭示人類原始生殖細胞的轉錄組和DNA甲基化圖譜  編輯切換為居中 人類原始生殖細胞產生于胚胎發(fā)育的早期，是發(fā)育為成熟的精子和卵細胞的前體細胞，精卵結合后會發(fā)育成新的個體、并將遺傳物質傳遞給下一代以維持種族的延續(xù)。因此，對人類早期胚胎以及原始生殖細胞的發(fā)育過程進行深入的研究對于理解人類胚胎發(fā)育特征以及對于反復流產、胚胎停育、不孕不育等疾病發(fā)病機制的認識具有重要意義。今天，我們就一起來看一篇利用單細胞甲基化測序技術研究原始生殖細胞的Cell封面文章（The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells）。 介紹 本文使用了作者開發(fā)的單細胞RNA測序(RNA-seq)方法分析了來自妊娠4至19周的15個胚胎的233個男性和女性原始生殖細胞(PGCs)以及其中13個胚胎的86個鄰近體細胞的轉錄本。此外，作者還利用全基因組測序技術(WGBS)分析了男性和女性性腺PGCs的DNA甲基組，以及其中11個胚胎在妊娠7-19周時的鄰近體細胞。 結果 人類PGC細胞轉錄圖譜 通過單細胞轉錄組研究了人類PGS細胞在7-19周的不同細胞不同發(fā)育階段的不同表達模式，首先，作者對單個生殖細胞及其鄰近的體細胞進行了非監(jiān)督的層次聚類分析，對照組選擇了11個來自胚泡內細胞團(ICM)的單個細胞。其中，作者對PGS細胞在有絲分裂及減數分裂階段的不同基因表達特點經行了深入的分析，結果表明人類有絲分裂的PGCs清楚地表達多能性標記基因，如Pou5f1(也被稱為OCT4)、NANOG、ZFP42(也被稱為REx1)、DPPA3(也被稱為Stella)、SALL4和Lin28a，但不像以前報道的那樣表達SOX2（圖1）。  編輯 人原始生殖細胞基因表達譜的動態(tài)變化 接下來，作者分析了ICM、PGCs和周圍體細胞之間的主要差異。作者發(fā)現了988個有絲分裂PGC特異基因和1,325個性腺體細胞特異基因(圖2A)。通路分析表明，PGCs高度富含與堿基切除修復(BER)途徑有關的基因，與處于類似發(fā)育階段的小鼠PGCs相似。這一發(fā)現表明，性腺PGCs可能對BER相關機制有很強的需求，可能是由于整體DNA去甲基化和其他表觀遺傳的重編程過程。此外，在體細胞的不同階段的特征性基因及所涉及的通路中，作者發(fā)現隨著發(fā)育的進程一些細胞全能性相關的基因表達在下降，并且發(fā)現同女性相比，男性性腺的PGS細胞具有更多的特異性表達基因(圖2C)。  編輯切換為居中 人女性生殖細胞X染色體的再激活 在小鼠雌性PGC發(fā)育過程中，失活的X染色體在E8.5至E12.5之間重新激活。作者通過分析X染色體上基因的表達來分析人類PGCs的這種行為。4~11周雄性PGCs X染色體上基因的總表達水平是雌性的1.6倍（圖3）。這表明失活的X染色體在4周后已經在雌性生殖細胞中重新激活。此外，作者還分析了X染色體上基因的等位基因特異性表達。在4周胚胎中，雌性生殖細胞顯示HDHD1基因的雙等位基因表達，而同一胚胎中的性腺體細胞顯示單等位基因表達。這表明，在妊娠4周后，原核細胞中失活的X染色體已經重新激活，并表現出雙等位基因的表達。  編輯 人PGCs的動態(tài)甲基組分析揭示了DNA低甲基化模式 為了了解DNA甲基化對基因表達的調節(jié)，作者還對人PGCs進行了WGBS分析。分析表明，13周和19周胚胎的雄性PGCs中的甲基化水平保持在較低水平，這意味著19周后雄性PGCs應該會發(fā)生整體重新甲基化。在PGCs的整體去甲基化過程中，性腺體細胞如預期的那樣保持了高水平的DNA甲基化。同時，作者還分析了女性生殖細胞的DNA甲基組情況。在10周胚胎中，雌性生殖細胞的DNA甲基化水平最低，這表明10周女性胚胎中的PGC以及11周男性胚胎中的PGC具有非常低甲基化的基因組(圖4A)。這表明，女性生殖細胞的再甲基化始于妊娠11周，這比男性生殖細胞的甲基化要早得多。且基因區(qū)的去甲基化與基因間區(qū)的高度甲基化同時存在，而5hmC的狀態(tài)與甲基化的模式相反(圖4G)。  編輯  編輯 人生殖細胞功能基因組元件的甲基化動力學研究 總體而言，不同功能基因組元件上的DNA去甲基化反映了整體模式，但程度不同。一些轉座子原件的活化與一些甲基化的殘基具有相關性。分析表明，在懷孕5周的時候PGS中90%以上的轉座子原件處于甲基化狀態(tài)，而到了10周或11周的時候這一數字降到了8%，一些進化上更年輕的轉座子原件，在整個基因組表現出低甲基化狀態(tài)時仍表現出更高的甲基化及基因表達狀態(tài)，說明了一些表觀遺傳性狀的可遺傳特征。 DNA甲基化與基因表達的關系 基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化通常代表相應基因的表達。作者分析了相應基因啟動子區(qū)域的RNA表達與DNA甲基化的關系。作者發(fā)現，即使在整體去甲基化后，這些區(qū)域之間的負相關性仍然存在于PGCs中，就像在體細胞中一樣。但是，與鄰近性腺體細胞的負相關程度，尤其是10周胚胎的雌性原生殖細胞，在原生殖細胞中較弱。這表明，盡管啟動子DNA甲基化仍然抑制基因在PGCs中的表達，但其調節(jié)程度明顯低于體細胞。然而，已有研究表明，基因體中的DNA甲基化通常與基因表達呈正相關。作者分析了這種差異，發(fā)現未表達的基因在基因體中的DNA甲基化水平仍然低于表達的基因，這表明基因體中的DNA甲基化仍然潛在地促進了PGC中的基因表達，盡管程度要小得多。 結論 人類遷移期到性腺時期PGCs的轉錄組和DNA甲基化組總體上與小鼠PGCs在可比階段的相似。同時，人PGCs也表現出不同于小鼠PGCs的獨特特性，具有獨特的轉錄模式，能同時表達多能性基因與生殖系特異的基因，此外，人類原始生殖細胞存在全基因組范圍的去甲基化。作者的工作為闡明人類PGCs整體表觀遺傳重編程過程中DNA甲基化和基因表達網絡的復雜關系鋪平了道路。 重點來了！ 關于單細胞及微量樣本DNA甲基化測序(Micro DNA-BS) 單細胞及微量樣本的DNA甲基化組學研究很大程度上受制于建庫技術。傳統(tǒng)的文庫構建方法或類似于基因組DNA的單細胞擴增技術很難應用到甲基化實驗過程中。易基因建立了一系列微量及單細胞甲基化檢測方法，可對于不同項目需求，個性化提供檢測方案，在全基因組、簡化基因組、靶基因等范圍開展甲基化檢測。 易基因建立的單細胞及微量樣本DNA甲基化測序技術包括：
應用方向： 單細胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應用于腫瘤發(fā)生機制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細胞重組，干細胞及細胞異質性等研究領域。應用的樣本包括單細胞、微量細胞、微量DNA等。特別適用于難以取得的珍稀樣本和細胞異質性較大的組織樣本。 技術優(yōu)勢： 1）微量細胞或單細胞全基因組甲基化測序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量： 單細胞/100-1000個細胞 1ng基因組DNA 90%以上基因組CG覆蓋 2）微量細胞或DNA簡化基因組甲基化測序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量： 1ng基因組DNA； 10-20M有效CG位點覆蓋； 20G測序數據量。 有DNA甲基化測序或組學研究的老師，可咨詢了解。 |
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