基因組異常是白血病發(fā)生的根源。近年來基因組測序技術的迅猛發(fā)展，大量位于蛋白編碼區(qū)的驅動突變和染色體易位得以鑒定，為白血病的診斷和治療提供了有力的理論支持。然而，編碼蛋白的基因序列僅占人類全基因組的2%，其余98%為非編碼區(qū)。目前對于非編碼區(qū)的突變如何影響白血病的發(fā)生和進展仍知之甚少。如何鑒定出關鍵的非編碼區(qū)驅動突變是一個很大的挑戰(zhàn)。

2022年6月，上海血液學研究所王侃侃研究員團隊在 Blood 期刊在線發(fā)表了題為：Recurrent non-coding somatic and germline WT1 variants converge to disrupt MYB binding in acute promyelocytic leukemia 的研究論文。

該研究通過整合全基因組測序與功能性調控元件分析，發(fā)現(xiàn) WT1 非編碼調控區(qū)體細胞突變和胚系變異通過破壞MYB染色質結合促進急性早幼粒細胞白血病發(fā)生。

上海血液學研究所王侃侃研究員為論文通訊作者，宋歡博士研究生、劉亞斌博士研究生為論文的共同第一作者。

聚焦于急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）發(fā)病相關的潛在功能性非編碼區(qū)突變，王侃侃團隊通過整合24例 APL 患者的配對全基因組測序和16例 APL 患者的表觀遺傳組測序，構建了 APL 相關順式調控元件（cis-regulatory elements，CREs）的突變圖譜。通過核心轉錄因子鑒定、轉錄因子結合區(qū)域富集分析以及轉錄因子結合基序的突變富集分析等，揭示了 CREs 上的體細胞突變傾向于發(fā)生在APL所必需的核心轉錄因子所結合的染色質區(qū)域，尤其顯著富集在 MYB, PU.1, IRF1 這三個“先鋒因子（pioneer factor）”的結合區(qū)域。進一步，研究者根據(jù)突變重現(xiàn)性、對靶基因轉錄影響以及表型相關性進行功能篩選，最終獲得了38個具有潛在功能性的非編碼調控區(qū)突變位點。

以 WT1 第三內含子區(qū)的重現(xiàn)性突變?yōu)槔撗芯窟M一步在169例 APL 患者中進行了擴大樣本檢測，發(fā)現(xiàn)13例患者含有該區(qū)域的變異，其中5例為體細胞突變（集中于chr11:32421395-32421397區(qū)域），7例為胚系變異（chr11:32421397 G>A為SNP位點——rs191528827），1例患者同時存在這兩種異常。值得注意的是，該SNP位點在非腫瘤中國人群中的頻率為0.82%，而在APL患者中的頻率為4.73%，提示 chr11:32421397 G>A 是一個新發(fā)現(xiàn)的APL風險變異位點，這也是首個在 APL 中報道的非編碼調控區(qū)域的風險變異位點。

為了探究 WT1 非編碼區(qū)體細胞突變和/或胚系變異對于 WT1 基因表達的影響，研究團隊通過一系列實驗觀察到，相比于野生型對照組，攜帶 WT1 非編碼區(qū)變異的 APL 患者，其第三內含子增強子區(qū)的組蛋白 H3K27ac 信號減弱，WT1 表達量顯著降低。與此同時，研究者還在多例攜帶 WT1 非編碼區(qū)變異的 APL 患者中觀察到 WT1 雙等位基因失活導致的 WT1 完全丟失現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)進一步支持了 WT1 在 APL 中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。

為了進一步揭示該非編碼區(qū)變異抑制 WT1 表達的機制，研究者通過熒光素酶報告基因實驗、DNA pulldown、ChIP-seq、CRISPR/Cas9 介導的基因編輯和染色質構象捕獲等實驗，發(fā)現(xiàn) WT1 非編碼區(qū)的突變和變異通過破壞 WT1 增強子區(qū) MYB 的結合序列，干擾 MYB 與染色質的結合，從而破壞 WT1 增強子與啟動子的空間相互作用，最終導致 WT1 表達下降。

值得一提的是，王侃侃團隊聚焦于 APL 中關鍵致病蛋白 PML/RARα 結合圖譜詮釋急性早幼粒細胞白血病發(fā)生新機制，在2021年3月的 Blood 期刊發(fā)表了題為：A PML/RARα direct target atlas redefines transcriptional deregulation in acute promyelocytic leukemia 的研究論文（第一作者為譚云博士、王曉玲博士、宋歡博士研究生）。該研究填補了以往研究中對 PML/RARα 融合蛋白轉錄激活功能的認識不足，重新定義了其在 APL 發(fā)病中的雙重調控功能；首次報道 ML/RARα 參與超級增強子調控，并發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸/三氧化二砷協(xié)同作用超級增強子所調控基因，從而解釋了協(xié)同靶向機制；揭示融合轉錄因子調控超級增強子在白血病發(fā)生中的重要性。本次報道的研究是此研究的延續(xù)和深入。

本次報道的研究為 APL 中首個聚焦于功能性非編碼突變的系統(tǒng)性研究工作，通過構建 APL 順式調控區(qū)的突變圖譜，鑒定出38個具有潛在功能的非編碼區(qū)突變位點，并以 WT1 為例首次報道了非編碼區(qū)突變對于 WT1 表達的影響以及具體的作用機制，同時揭示了一個新的 APL 風險變異位點。該研究強調了非編碼區(qū)突變在 APL 發(fā)病中的重要性，為白血病及其他疾病非編碼區(qū)功能性突變的篩選鑒定以及功能驗證提供了全新的研究思路和策略。