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文獻分享——2014-在白血病患者中識別Pre-leukaemic HSCs
內(nèi)容目錄
前言關于作者背景知識克隆性造血相關內(nèi)容白血病細胞相關內(nèi)容NPM1基因PART1-非白血病細胞中DNMT3A突變的檢測PART2-DNMT3A突變的HSCs仍可多系分化PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化療PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆擴增討論后記
前言
今天回過頭來看之前看過的一篇文章，發(fā)現(xiàn)有的居然已經(jīng)忘了一大半了，又得從頭來看，真的比較費時間。所以，干脆一次辛苦，方便以后了，把主要的內(nèi)容整理成筆記好了。
這次的文章是以色列威茨曼研究所的Shlush在2014年發(fā)表在Nature上的一篇研究：
論文標題：Identification of pre-leukaemic haematopoietic stemcellsinacuteleukaemia
論文地址：https://www./articles/nature13038
關于作者
這里有2個共一作者：Liran I. Shlush 和 Sasan Zandi，通訊作者是John Dick。
其中關于Shlush，我們都相對比較熟悉了，目前在威茨曼研究所。Zandi和Shlush一樣，過去都是在John Dick Lab里做研究，現(xiàn)在也都畢業(yè)了。
放一個他們lab的網(wǎng)站，有興趣的話自己去看看吧：
John Dick Lab：http://www./
背景知識
克隆性造血相關內(nèi)容
白血病細胞相關內(nèi)容
CD33是髓系細胞分化抗原，分子量為67KD，主要分布在髓系血細胞，特別是在分化的早期階段。CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表達。
這里要注意：CD33是可以在髓系血細胞表達的，如果想要表示AML中blast細胞，則還要加上CD45dim
NPM1基因
NPM1基因位于染色體5q35，其編碼的核磷蛋白具有多種重要的功能，如阻礙核仁蛋白的聚集，調節(jié)核糖體蛋白的裝配以及這些蛋白在核與質之間的轉運，啟動中心體的折疊，具有分子伴侶作用，并可通過多種信號通路調節(jié)細胞增殖和凋亡。NPM1 基因突變在 AML 的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。
NPM1突變常發(fā)生于12號外顯子，目前報道的有40多種不同的突變類型, 其中以A型突變最常見，約占70%-80%，表現(xiàn)為在第960-961位核苷酸之間插入TCTG。
盡管NPM1突變的類型不一，但均屬于移碼突變，導致核定位信號異常，從而使核磷蛋白由核內(nèi)易位于胞質，該異常定位不但可影響蛋白質的正常功能，同時對某些腫瘤抑制基因ARF、P53 的正常通路及功能也產(chǎn)生一定的影響。
NPM1基因突變的發(fā)生率在FAB各亞型中亦具有異質性，見于除M3外的各亞型，在M4和M5中發(fā)生率較高。
NPM1基因突變是AML預后相對較好的判斷指標。這可能與NPM1突變患者對化療藥物較敏感有關。研究發(fā)現(xiàn)在AML中，核轉錄因子NF-KB的活化是白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因，在NPM1突變的白血病細胞中，核磷蛋白由核內(nèi)易位于胞質，與胞漿中的NF-KB蛋白相互作用，導致NF-KB被分解，活性降低，從而減弱NF-KB與DNA的結合能力，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。
注意：當NPM1基因突變后，可以直接寫成NPM1c
PART1-非白血病細胞中DNMT3A突變的檢測
使用深度靶向測序技術，對12個初診AML患者的外周血DNA進行靶向測序，主要針對的靶基因有103個：
| ABL1 | ADAR | ADARB2 | ASMTL | ASXL1 | ATM | BCOR |
|---|
| BCORL1 | BRAF | CBL | IL3RA | CD44 | CDH23 | CDKN2A |
| CDKN2B | CEBPA | CHD2 | CNOT3 | CREBBP | CRLF2 | CSF1R |
| CSMD3 | DDX3X | DNMT3A | DNMT3B | EBF1 | ECT2L | EED |
| EGR2 | EP300 | EZH2 | FBXW7 | FLT3 | GATA1 | GATA2 |
| GATA3 | GLI1 | GLI2 | HELLS | HNRNPA1 | HNRNPR | HRAS |
| HYDIN | IDH1 | IDH2 | IKZF1 | IL7R | JAK1 | JAK2 |
| JAK3 | KIT | KLHL6 | KRAS | LPHN3 | LRP1B | MECOM |
| MED12 | MLH1 | MLL | MPL | MSH2 | MSH6 | MUC2 |
| MUC4 | MYD88 | NF1 | NOTCH1 | NPM1 | NRAS | NXF1 |
| PAX5 | PCLO | PDGFRA | PDGFRB | PHF6 | PIK3CA | PIM1 |
| POT1 | PTEN | PTPN11 | RELN | RIMS2 | ROR1 | RUNX1 |
| SEMG2 | SF3B1 | SI | SIRPA | SLC4A10 | SMC3 | SMO |
| SRSF2 | SUZ12 | SYK | TBL1XR1 | TET2 | TP53 | TP53INP1 |
| TTN | U2AF1 | UMODL1 | WT1 | XPO1 |
|
|
主要針對CD33+的AML細胞和作為正常對照的T細胞進行測序：
4/12人有DNMT3A突變（9，10，11，12）
3/4人中正常T細胞內(nèi)也可以找到突變（9，11，12）
在AML細胞中的DNMT3A突變VAF值較高，而正常T細胞中的DNMT3A突變VAF值較低
為了看一看在AML患者中DNMT3A突變的情況，作者又找來一批樣本——71個確診為AML的患者，取初診時患者體內(nèi)正常遺傳學的血細胞進行一代sanger測序：
找到這些樣本后，對這17個人做ddPCR（定量分析）檢測VAF值，結果如上圖：
又對其中2個樣本檢測了FLT3-ITD：
可以看到其中：在CD33+的AML細胞中可以發(fā)現(xiàn)有FLT3-ITD的存在，而在正常T細胞中基本上沒有，在第2個患者中的MLP細胞中有發(fā)現(xiàn)。
由此作者推斷說，突變發(fā)生有一定的順序：
早期先有DNMT3A突變
而后出現(xiàn)NPM1c和FLT3-ITD
這樣推斷的話，其實也還算是有邏輯性的吧。
PART2-DNMT3A突變的HSCs仍可多系分化
為了探索DNMT3A突變細胞起源，因為目前認為DNMT3A先在正常細胞中出現(xiàn)，慢慢發(fā)展到AML細胞中，所以于是對11個DNMT3A突變/NPM1c的AML個體中正常細胞（CD33-）進行測序。
同時取了3個時間點的樣本——初診、緩解和復發(fā)。
關于流式分選策略：
CD33- CD34+ CD45dim CD38- ：
MLP：CD45RA+
HSC：CD90+ CD45RA-
MPP：CD90- CD45RA-
CD33- CD34+ CD45dim CD38+ CD7- CD10- ：
CMP：CD45RA- CD135+
MEP：CD45RA- CD135-
GMP：CD45RA+ CD135+
作者對上述分選出來的AML患者體內(nèi)正常HSPCs細胞和AML中blast細胞（CD33+ CD45dim）進行ddPCR對DNMT3A和NPM1c做定量檢測：
上面的圖a和下圖b都是一個比較典型的患者數(shù)據(jù)——no.11號患者：
從圖a中可以得到的結論有（細胞數(shù)量差異）：
在不同時間點下細胞數(shù)組成差異較大，處于發(fā)病狀態(tài)下時，CD33- CD34+ CD45dim 細胞數(shù)減少，HSC細胞數(shù)減少。
如果把從初診→緩解→復發(fā)整個過程看作一個時間序列，那么：
細胞數(shù)一直增加的有：MLP、GMP
細胞數(shù)一直減少的有：MPP、CMP、MEP
從圖b中可以得到的結論有（克隆大小差異）：
在初診時，NPM1c克隆相對較小，只有GMP和Blast細胞中存在。在復發(fā)轉移時，NPM1c克隆則在成熟和不成熟細胞中均有表達，且GMP中NPM1c克隆長大了。
在緩解期間，NPM1c被全部清除。只有DNMT3A突變的存在。說明DNMT3A突變克隆不是AML致病克隆。
不同時間點下：在HSC/MPP細胞中，僅帶有DNMT3A突變，而沒有NPM1c突變?？赡躈PM1c并不是來自HSC中，而是從下游的祖細胞而來。
復發(fā)的Blast細胞中DNMT3A的VAF變小，可能是因為一旦發(fā)病后，DNMT3A就不再是主要的克隆，而慢慢減小。
下面對11個個體中的突變情況進行分析（不過文中沒有具體說明這個樣本的時間點，但是根據(jù)b圖可以看出這個樣本應該是在初診時采集的）：
不成熟的HSPCs（如HSC、MPP、CMP、MEP、MLP和GMP）都可以檢測到DNMT3A突變，而成熟細胞（如T、B和NK細胞）中很多沒有DNMT3A突變。這一點的話和疾病相關吧，因為AML就是分化阻滯嘛，即使不成熟細胞中帶有突變，在向下分化過程中肯定會有阻滯在某個階段，然后成熟細胞中就帶有較少的突變。
這里作者說這個證據(jù)可以說明DNMT3A突變可以促進AML中NPM1c的發(fā)生？？有點疑惑？？
有3個人的數(shù)據(jù)——10、16和14，他們在HSC/MPP時沒有DNMT3A突變，而到了CMP時就有了DNMT3A突變，有2種解釋：1）因為HSC/MPP時VAF比較低，檢測技術測不到。2）可能這個突變是在HSC/MPP→CMP過程中獲得的。
但是我發(fā)現(xiàn)有個患者非常奇怪——28號。HSC/MPP時就存在DNMT3A突變，到了CMP時卻沒有了？？到了MEP后又出現(xiàn)了，而且還是DNMT3A突變和NPM1c共存？？好像這個現(xiàn)象不局限于28號，在57、35、16、36、14中都有這個現(xiàn)象。
有想法的同學歡迎來討論。
PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化療
對下圖有個詳細的分析：
與初診時相比，在緩解和復發(fā)時，DNMT3A突變的VAF值略高或基本一致。
初診和復發(fā)時的CD33+的blast細胞會同時攜帶DNMT3A突變和NPM1c突變。而緩解期的CD33+細胞只有DNMT3A突變，說明這些細胞不是AML細胞，而是僅僅攜帶有DNMT3A突變的干祖細胞（具有向下分化的能力）
在復發(fā)的樣本中，大多細胞類型都具有2個突變，而只有HSC和MPP細胞只帶有DNMT3A突變。說明HSC/MPP細胞并不是真正的AML細胞，在HSC/MPP→CMP/MLP過程中可能獲得新的突變，出現(xiàn)pre-leukaemic HSCs細胞。
no.57患者生存時間較長，所以可以通過觀察這個樣本，比較早期緩解（3個月）和晚期緩解（36個月）時DNMT3A突變的情況：
一些部分CD33+細胞，在緩解晚期（36個月）會出現(xiàn)類似初診時同時攜帶DNMT3A突變和NPM1c的克隆，這說明：
小結：
因為在緩解和復發(fā)過程中，DNMT3A突變一直存在，所以認為Pre-leukaemic可以耐受化療。
PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆擴增
為了檢驗DNMT3A突變的HSC是否有功能上的改變，在重建時是否有優(yōu)勢，作者進行了移植實驗。
實驗樣本：
11號患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=30%）和55號患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=20%）中的外周血單個核細胞
極限稀釋LDA移植到免疫缺陷小鼠股骨內(nèi)
在移植后第8和16周流式分析檢測股骨內(nèi)的植入物細胞組成
白血病細胞植入物定義為：CD45dim CD33+
非白血病細胞植入物的話是一個混合物，認為既有淋系（CD19+B細胞），也有髓系細胞（CD33+）
其實這里我是有點疑問的，為什么只CD33這個來分析，非常矛盾，我們一般認為CD33是白血病細胞，正常髓系細胞的話可以用其他的marker吧？？
對于no.11患者：
no.11患者初診和復發(fā)樣本移植到小鼠16周時的數(shù)據(jù)結果：
說明與初診時相比，復發(fā)時LSC數(shù)目更多。
又對于no.11患者比較不同植入物的組成以及VAF情況：
僅有DNMT3A突變的小鼠有9/12只，平均VAF=57%
同時有DNMT3A突變和NPM1c的有2只，其中12號的植入物中CD33細胞比例較高
只有一個植入物中超過50%的都是CD33+細胞（12號小鼠），植入物中DNMT3A和NPM1c的突變VAF都相對較高（是Blast細胞）。
又做了一個動力學實驗，分別檢測初診時外周血樣本，植入小鼠8周、16周后的植入物VAF：
關于這個圖如何看：
圖中第一列2個點分別是HSC和MPP中VAF的值
第二、三列中每個點代表一個小鼠中植入物的VAF值
可以得到的結論：隨著時間的進展，DNMT3A突變的VAF越來越高。
個人覺得以上描述非常的混亂，所以我就簡單寫下我自己的理解：
通過圖b，我們可以看到12號小鼠中，植入物數(shù)目是白血病blast細胞為主，而且突變信息驗證了這一點。而3號小鼠中，植入物數(shù)目中白血病blast細胞相對于其他較多，但是突變信息中證實這些都是正常的細胞。
上面的數(shù)據(jù)表明：
HSC/MPP中發(fā)生DNMT3A突變可以向下繼續(xù)分化。所以認為這樣的細胞就是所謂的pre-leukaemic HSCs
DNMT3A突變可以帶給pre-leukaemic HSCs一定的造血重建優(yōu)勢。
小鼠移植模型說明，當pre-leukaemic HSCs數(shù)目遠遠高于LSC時，會主要產(chǎn)生非白血病細胞植入物。
接下來作者用自己手上有的264歷史臨床AML樣本移植到小鼠中的數(shù)據(jù)，總結了下移植物的細胞組成情況：
37%沒有植入物
40%是白血病植入物
23%是非白血病植入物
于是作者又找到了手上有的歷史數(shù)據(jù)——264個樣本中有25個患者有一代sanger測序數(shù)據(jù)：
使用一代sanger測序方法對25個樣本進行分析植入物的情況：
因為這是歷史數(shù)據(jù)，所以沒法確定到底這些植入物的來源是pre-leukaemic HSCs還是LSC。
前面證明了pre-leukaemic HSCs中是攜帶有DNMT3A的，那么pre-leukaemic HSCs會不會攜帶有IDH1/2呢？如果能證明pre-leukaemic HSCs中攜帶有IDH1/2也許也能說明前面的問題，這些植入物來源于pre-leukaemic HSCs。于是用ddPCR對52，64，77號患者初診時的樣本流式分選細胞分別進行檢測NPM1c和IDH2的突變VAF：
討論
確定了在白血病的發(fā)生過程中，DNMT3A→NPM1c及FLT3突變的大致順序。
確定了在診斷時pre-leukaemic HSCs的存在，并且如果基于他們的數(shù)據(jù)，大概有25%的AML患者中有DNMT3A突變的存在。
確定了DNMT3A突變的HSC/MPP有重建的優(yōu)勢。
因為在緩解和復發(fā)過程中，DNMT3A突變一直存在，所以認為Pre-leukaemic可以耐受化療，目前一些針對Pre-leukaemic突變的藥物如IDH抑制劑之類的，也許可以在他們產(chǎn)生更強耐藥性前徹底清除這些克隆。
后記
老實說，看Shlush的文章真的讓人焦頭爛額，可能還是自己沒能達到那個層次吧，先這樣吧??
