蛋白是生物功能的主要體現(xiàn)者，蛋白的表達水平、活性強弱和相互作用等與生物學功能密切相關(guān)，如復制轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導、新陳代謝、抗體藥物等，錯誤的蛋白相互作用會引起紊亂和疾病。因此，蛋白的相互作用分析成為目前生物大分子研究中必不可少的重要手段。
蛋白-蛋白相互作用分析方法有很多，比如ELISA、CoIP、FRET、Y2H等，但這些方法往往受到需要標記、檢測靈敏度低、假陽性高、無法定量等限制。以Biacore為代表的表面等離子體共振（SPR）技術(shù)，無需對分子進行標記，能夠?qū)崟r觀測微量、靈敏、快速、動態(tài)的定量表征結(jié)合過程，為正確全面地判定分子間相互作用提供可靠的數(shù)據(jù)支持！
Biacore在蛋白-蛋白相互作用領(lǐng)域的研究涉及到科學研究的很多方面，比如：
（1）結(jié)構(gòu)生物學
（2）病毒入侵機制
（3）植物調(diào)控的分子機理，抗逆機制
（4）轉(zhuǎn)錄因子
（5） 食品含量測量
（6）疾病的分子機理研究等
接下來以BiacoreT200儀器為例，解析蛋白與蛋白互作實驗操作流程。

Biacore T200 檢測蛋白與蛋白結(jié)合操作指南

實驗前準備
·   S 系列 CM5 芯片，貨號：29-1049-88 ( 一片裝 )、BR-1005-30 ( 三片裝 )、29-1496-03 ( 十片裝 )，
( 注：每張芯片若一次性使用，可檢測三對不同的互作，若再生后重復使用，只要蛋白一直有活性，就可一直使用 )。
·   氨基偶聯(lián)試劑盒 ( 貨號：BR-1000-50),( 注：里面 的 EDC 和 NHS，溶解后，200ul 每管分裝，-20℃凍存， 后續(xù)實驗前，各取一管融化后使用即可 )。
·   偶聯(lián) Buffer：10mM 醋酸鈉 pH4.0 ( 貨號：BR-1003-49 )，或 10mM 醋酸鈉 pH4.5 ( 貨號：BR-1003-50 )。

·   緩沖液：10 x HBS-EP+ ( 貨號：BR-1006-69 )，用去離子水稀釋10 倍，配置500 mL，置于T200 系統(tǒng)左側(cè)托架上，將緩沖液進液管 A 插入瓶中。
·   再生溶液 Glycine 1.5 ( 貨號：BR-1003-54 )。( 也可掃描右側(cè)的二維碼選擇含上述所有耗材的套餐 )

·   無蓋 1.5 ml EP 管 ( 貨號：BR-1002-87 )。

·   蛋白 A 和蛋白 B：母液濃度＞ 0.2 mg/mL，蛋白總量至少各 20 μg。

實驗步驟
芯片的放置與緩沖液置換
·   將運行緩沖液，水瓶，廢液瓶分別放置在左右托盤中，并插入相應的進液管。

·   點擊 Biacore T200 Control Software 工具條中的 或  ，點擊 Eject Chip，打開芯片艙門。選擇New Chip，現(xiàn)在 Chip type 為 CM5。

以本實驗為例
·   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭頭方向，將芯片輕輕推入卡槽，最后合上芯片艙的艙門。點擊 Dock Chip。結(jié)束后，選擇 Tools → Prime 命令，點擊 Start。結(jié)束后，點擊 Close，系統(tǒng)自動轉(zhuǎn)入待機 (Standby) 狀態(tài)。

蛋白 A 偶聯(lián)
·   點擊控制軟件 File 下面的 Open/New wizard template，選擇 immobilization，雙擊。在 Chip type 中選CM5，在 Flow cells per cycle 選 1。勾選 Flow cell 2，method 選用 amine，Ligand 輸入配體名稱 ( 本實驗為A)，選用 aim for immobilized level，Target level 輸入配體目標偶聯(lián)量 ( 參考表一 )。點擊 2 次 Next。

表 1. 偶聯(lián)量與配體工作濃度參考表

·   將 Reagent Rack 改為 Reagent Rack1，點開左下方 Menu 后選 Automatic Positioning，Vial siza 選項選擇Medium，若要合并相同樣品，pooling 選項選擇 yes，點擊 OK。根據(jù)下圖中樣品名稱及體積 ( 大于該指定體積即可 ) 進行樣品準備。配體蛋白用 pH4.0 的醋酸鈉溶液稀釋至對應濃度 ( 參考表一 )。點擊左下方Eject Rack，取出樣品架，將準備好的樣品放到對應位置。蓋上試管架蓋子，將樣品架送回樣品艙。
( 注：所有 EP 管的蓋子務必剪去 )。

·   點擊Next，點擊 start，保存 method 與result 文件。系統(tǒng)將自動在芯片表面包被目標偶聯(lián)量的配體蛋白， 并自動生成偶聯(lián)報告。
·   偶聯(lián)結(jié)束后，即可進入下一步實驗，無需等待基線平衡。

多循環(huán)動力學檢測
·   點擊控制軟件 File 下面的 Open/New wizard template，雙擊 Kinetics/Affinity。將 Flow path 點為 2-1 ( 如果蛋白偶聯(lián)在 flow cell 4，則選 4-3 )，Chip type 選擇 CM5。點擊 Next。

·   Startup 中 Solution 填 HBS-EP+，Number of cycle 改為 5，點擊 Next。Sample 中 Contact time 為 180s ( 或 120s )， Dissociation time 為 300s，Regeneration 中 solution 為 Glycine 1.5。點擊 Next。

·   Kinetics/Affinity-Sample 界面，填寫分析物信息：Sample id 填寫樣品名稱， Concentration 填寫分析物系列濃度( 由低到高、五倍稀釋)，注意濃度單位選擇，推薦濃度如下：偶聯(lián)結(jié)束后，即可進入下一步實驗， 無需等待基線平衡。 
 
·   點擊 2 次 Next。將 Reagent Rack 改為 Sample and Reagent Rack1( 或根據(jù)樣品數(shù)量選擇其他 rack 或 96/384 孔板)，再點開左下方 Menu 后選Automatic Positioning，Vial siza 選項選擇 Medium，若要合并相同樣品， pooling 選項選擇 yes，點擊 OK。根據(jù)下圖樣品名稱及體積 ( 大于該指定體積即可 ) 進行樣品準備。蛋白B 母液先用左托盤中的運行緩沖液 1x HBS-EP+ 稀釋至 100μM，再用 1x HBS-EP+ 進行 5 倍稀釋。點擊左下方 Eject Rack，取出樣品架。根據(jù)圖示樣品位置進行放置，蓋上試管架蓋子，將樣品架送回樣品艙。( 注： 所有 EP 管的蓋子務必剪去 )。點擊 Next，對方法進行保存，再對數(shù)據(jù)路徑 ( 可使用系統(tǒng) 默認的，也可自行指定，注意所保存的文件名及指定文件夾名均不能有中文字符 ) 進行保存，儀器便會開始自動運行。
         

結(jié)果分析
·  打開 Biacore T200 Evaluation Software，點擊 ，找到保存的結(jié)果文件。點擊左側(cè) Plot 中的 Binding to reference，檢查各個點是否趨于一致或小于 binding level 中對應響應值的 20%，再檢查 binding level 各個點的響應值是否存在明顯的濃度依賴。如是，直接跳到下一步。注：若 Binding to reference 各個點的響應值也存在濃度依賴且大于 binding level 中對應響應值的 20%，即存在非特異性結(jié)合。此時可嘗試提高運行緩沖液中鹽離子濃度或提高 P20 ( 貨號：BR-1000-54 ) 濃度不超過 1%，或者調(diào)換配體與分析物，將B 偶聯(lián)在芯片上，將 A 作為分析物。若 baseline 中各個點的響應值上飄，可適當延長 glycine 1.5 溶液的進樣時間。
·  點擊上方中間位置的 Kinetics/Affinity，在下拉欄里點擊 Surface bound，在跳出的窗口中選擇不同的濃度進行擬合。選擇標準為：如果最高濃度響應值大于 500 RU，選最低的 5 個濃度分析，如果最高濃度響應值小于 50 RU，選最高的 5 個濃度進行數(shù)據(jù)分析，介于兩者中間，隨意選 5 個連續(xù)的濃度進行分析。不需要的濃度，可在樣品濃度表格中將此濃度前的對號去掉即可。
 

·  點擊右下角 Next，再點擊右下角 Kinetics ( 當傳感圖為 “ 快上快下 ” 時，選 Affinity )，點擊左上角 Fit 進行數(shù)據(jù)擬合，點擊右下角 Finish 完成。
·  在下方數(shù)據(jù)顯示欄里，Quality Control 的前三項都亮綠燈表示檢測數(shù)據(jù)好；如果亮黃燈，表示數(shù)據(jù)能接受；如果亮紅燈，表示數(shù)據(jù)不能接受，需要優(yōu)化實驗。數(shù)據(jù)顯示欄的 Report 中顯示具體的分析數(shù)據(jù)，包括動力學數(shù)據(jù)ka、kd，親和力數(shù)據(jù) KD 等。以本實驗為例，動力學數(shù)據(jù)：Ka = 3672 M-1s-1，Kd = 0.001807 s-1， 親和力：KD = 4.921 × 10-7 M。
·  將鼠標放在圖上，點擊右鍵可以直接 copy graph ( small，medium，large ) 用于文章發(fā)表，也可以右鍵點擊 export curve，導出 txt 文本后自行用第三方軟件作圖。