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文章題目：Single-cell multi-omics reveals dyssynchrony of the innate and adaptive immune system in progressive COVID-19
日期：2022年1月21日
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
DOI：https:///10.1038/s41467-021-27716-4

摘要：

SARS-CoV-2病毒的免疫反應(yīng)失調(diào)是COVID-19重癥的原因。然而，與免疫病理相關(guān)的免疫信號知之甚少。在這里，該項研究使用多組學單細胞分析來探討COVID-19穩(wěn)定或進展期住院患者的動態(tài)免疫反應(yīng)和探索V(D)J庫，并評估托珠單抗的細胞效應(yīng)。基因表達和細胞系蛋白標記的協(xié)調(diào)分析顯示，S100A^hi/HLA-DR^lo經(jīng)典的單核細胞和激活的LAG-3T細胞是進展性疾病的標志，并分別強調(diào)了骨系細胞和T細胞上MHC-II/LAG-3的異常相互作用。該項研究還發(fā)現(xiàn)，在擴大的效應(yīng)細胞CD8⁺ 克隆、未突變的IGHG⁺ B細胞克隆和具有穩(wěn)定體細胞超突變頻率的突變B細胞克隆中，T細胞受體儲備出現(xiàn)傾斜。總之，該項研究深入的免疫分析揭示了在進展期COVID-19中先天和適應(yīng)性免疫相互作用的非同步性。

數(shù)據(jù)信息：

數(shù)據(jù)已存入GEO數(shù)據(jù)庫，號碼為GSE155224。可以通過COVID-19細胞圖譜數(shù)據(jù)挖掘網(wǎng)站(www.^[1])進一步研究這些結(jié)果。這個用戶友好的網(wǎng)站有一個圖形用戶界面，可以快速可視化scRNA-seq數(shù)據(jù)，用戶可以探索所有細胞類型中單個基因或感興趣的基因集的表達水平，比較COVID-19與對照組、進展期與穩(wěn)定期患者，數(shù)據(jù)集中所有免疫細胞的早期和晚期時間點。

結(jié)果解讀：

1.在COVID-19中，PBMC亞型隨著時間和疾病嚴重程度的變化而變化

在當前的研究中，該項研究試圖更深入地了解COVID-19患者在疾病嚴重程度和疾病病程中的免疫反應(yīng)。為此，采用單細胞方法研究了10名患者在不同時間點的18份PBMC樣本。使用年齡和性別匹配的健康受試者(n=13)作為對照。采用基于液滴的單細胞平臺(10x Chromium)進行單細胞RNA測序，以構(gòu)建5’基因表達文庫、表面蛋白文庫(CITE-seq)、T細胞受體(TCR)文庫和B細胞受體(BCR)文庫。過濾和清理后153,554個細胞被納入scRNA-seq分析。此外，也獲得所有患者的臨床和實驗室信息，包括病毒載量和細胞因子組。

樣本來自穩(wěn)定和進展中的COVID-19患者，是耶魯大學COVID-19 IMPACT(實施針對冠狀病毒的醫(yī)療和公共衛(wèi)生行動)生物庫的一部分。曾在ICU接受治療并最終死亡的危重患者(n=4)定義為病情進展患者，病情穩(wěn)定的重癥患者(n=6)在內(nèi)科病房住院并最終康復(fù)出院。該項研究分析了每個患者兩份不同血液樣本的PBMCs，早期(A)和晚期(B)時間點，除了兩個進展期患者(TP8, TP9)，他們只有一個樣本。根據(jù)臨床參數(shù)，80%的受試者接受了托珠單抗治療。分別取A時間點和B時間點處理前和處理后的樣品。對照組和COVID-19患者的基線特征相似，包括年齡和性別，而歐洲血統(tǒng)的個體在對照組中更普遍。進展期患者與穩(wěn)定組在基線特征、共病和時間線方面沒有差異。進展期患者的改良SOFA評分(一種進展期嚴重程度評分)明顯更高。

在兩個時間點，在對照、穩(wěn)定和進展樣品中檢測到特定細胞類型的相對豐度的一些差異。進展期患者初發(fā)T細胞(CD4⁺ 和CD8⁺ )相對減少，漿母細胞和分裂T 和NK細胞在COVID-19患者與對照組的對比增加。干擾素(IFN)激活的CD8⁺ T細胞簇是一個由191個細胞組成的簇，其特征是IFN刺激基因(ISGs)的高表達，幾乎只在COVID-19患者中發(fā)現(xiàn)，特別是在時間點A中。

經(jīng)典的單核細胞群亞聚成兩個不同的群體：一個是HLA-DR低表達的群體，這是一種主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II類分子，后被稱為S100A^hi/HLA-DR^lo單核細胞。與對照組相比，COVID-19患者的S100A^hi/HLA-DR^lo群集比例較高，這與之前的研究一致。另一方面，非經(jīng)典單核細胞(標記物FCGR3A)在COVID-19中減少，這也與最近的研究一致。COVID-19患者的髓樣樹突狀細胞(DC)也減少。總之，對穩(wěn)定和進展期COVID-19患者在不同時間點的PBMCs進行了全面的圖譜，捕獲了特定細胞類型相對豐度的動態(tài)變化，反映了免疫系統(tǒng)對病毒的反應(yīng)

2.在COVID-19中，I型干擾素信號主導(dǎo)外周血免疫細胞

進一步分析了每種細胞類型的基因表達變化以及疾病隨時間進程的變化。COVID-19中所有細胞類型的I型干擾素(IFN-I)反應(yīng)均升高，尤其是在時間點A，在進展期受試者中更是如此。所以在樣本水平上，IFN-I評分與同期病毒載量之間存在很強的相關(guān)性，與健康對照組相比，COVID-19患者中所有主要細胞類型的常規(guī)ISGs，如IFI6、IFI44L、LY6E和ISG15顯著增加。雙調(diào)節(jié)蛋白(AREG)是表皮生長因子受體(EGFR)的一種配體，不是人類的主要ISG，在健康對照PBMCs中幾乎檢測不到，但在COVID-19患者的單核細胞、T細胞、NK細胞和DCs顯著增加。盡管AREG是在傷口修復(fù)和炎癥解決方面扮演重要角色，但是據(jù)報道，它的表達也在肺部的病毒感染中增加并會在SARS-CoV感染的小鼠模型中誘導(dǎo)嚴重的肺病。IFN-I信號通路在小鼠骨髓細胞AREG誘導(dǎo)中起重要作用。最近一份報告顯示，COVID-19患者外周血單核細胞中AREG增加，支持AREG在SARS-CoV-2誘導(dǎo)的肺病理中可能發(fā)揮的作用。

3.IFN-I應(yīng)答隨著時間的推移與病毒清除而降低

COVID-19疾病的時間進程以許多基因的轉(zhuǎn)移和配體受體相互作用為特征。正如預(yù)期的那樣，所有患者和所有細胞類型的IFN-I評分從時間點A(更早抽血)到時間點B(更晚抽血)顯著下降，與這些時間點之間的病毒載量下降相對應(yīng)。值得注意的是，在A和B時間點IFN-I得分的下降與它們之間的時間差異有很強的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)表明在大多數(shù)患者中，最初升高的IFN-I反應(yīng)隨著時間的推移和病毒載量的減少而下降。有趣的是，在一些進展性患者中，IFN-I反應(yīng)似乎持續(xù)存在，與病毒清除降低相一致。

4.顯著的基因表達變化區(qū)分進展期患者與穩(wěn)定期患者

該項研究觀察到，在所有細胞系中，穩(wěn)定和進展患者之間存在顯著的基因表達差異。在進展患者中，ISGs的表達在所有細胞類型中都增加并且骨髓細胞和其他幾種細胞類型的抑制性細胞因子IL10表達也出現(xiàn)增加。據(jù)該項研究最近的研究以及其他研究報道，血漿中IL-10水平在嚴重的COVID-19中升高，并且IFN-I可誘導(dǎo)IL-10表達，從而在某些條件下限制免疫相關(guān)組織損傷。與ISGs相似，血漿IL-10水平從時間點A下降到時間點B，盡管在更大的隊列患者中，這種下降只出現(xiàn)在穩(wěn)定的非ICU患者中，而在ICU患者中IL-10水平保持較高。該項研究觀察到PBMCs中IFN-I評分與血漿IL-10水平之間存在中度正相關(guān)，這可能支持在COVID-19患者中觀察到的IFN-I反應(yīng)強度與IL-10抑制反應(yīng)之間的相關(guān)性。此外，該項研究觀察到與穩(wěn)定期患者者相比，進展期受試者的抗原提呈細胞(APCs)中MHC-II轉(zhuǎn)錄本降低，后者更類似于對照受試者。眾所周知，IL-10的增加會下調(diào)MHC-II、這可能解釋了進展期受患者的下降?？傊?，在進展期患者中，IL-10增加和MHC-II減少的抑制信號可能是一把雙刃劍:一方面，減少炎癥和保護組織免受免疫相關(guān)損傷，另一方面，阻礙有效抗病毒反應(yīng)的能力。

5.進展期患者表現(xiàn)為S100A^hi/HLA-DR^lo髓系表型

為了更好地理解穩(wěn)定型和進展期COVID-19單核細胞之間的轉(zhuǎn)錄差異，該項研究在排除對照組細胞后對其進行亞聚類。在7個簇中產(chǎn)生23,701個單核細胞。該項研究在穩(wěn)定和進展期的病人細胞中確定了一個清晰的分界, 這部分是由進展期患者中ISGs的表達增加所驅(qū)動的, 調(diào)節(jié)和組織修復(fù)相關(guān)基因在進展期單核細胞與穩(wěn)定期單核細胞中增加，包括CD163、IL1R2、AREG、共抑制受體HAVCR2(編碼TIM-3)及其配體LGALS9(編碼Galectin-9)和IL10。在進展期患者中，編碼具有抗病毒活性(主要針對單鏈RNA病毒)的RNASE2蛋白的表達也增加了。值得注意的是,LGALS9表達增加不僅在髓細胞還在B細胞和進展期患者的CD4⁺T細胞, 這表明TIM-3/Gal-9通路在髓系細胞/T細胞相互作用中具有潛在的作用，可以增強進展期患者髓系細胞的調(diào)節(jié)表型，如在癌癥患者中觀察到的。

如圖所示，進展期單核細胞中MHC-II分子減少。警報素S100A8/S100A9在進展期單核細胞與穩(wěn)定期單核細胞中的DEGs中排名最高。值得注意的是，S100A8/9的表達也受托珠單抗治療的影響。由于S100A9是骨髓源性抑制細胞(MDSCs)的標記物，并能促進IL-10的生成和MDSCs的抑制能力，進展期患者的單核細胞特征與MDSCs有些類似。事實上，兩個經(jīng)典單核細胞簇中的一個富含MHC-II低表達的MDSCs相關(guān)基因(S100A8,S100A9,IL1R2, IL10)。此外，該單核細胞簇顯示出與最近發(fā)現(xiàn)的嚴重敗血癥單核細胞群高度重疊的轉(zhuǎn)錄特征。出乎意料的是，與對照組相比，在進展期和穩(wěn)定期患者中，促炎單核細胞標志物IL1B和TNF在COVID-19單核細胞中均下調(diào)，盡管在穩(wěn)定期患者中IL1B的下調(diào)略低。這一觀察結(jié)果與最近報道的COVID-19嚴重呼吸衰竭患者的免疫抑制表型一致

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了進展期患者單核細胞的扭曲調(diào)控特征，類似于免疫癱瘓。鑒于這些與免疫抑制表型相關(guān)的基因中有許多是受IFN-I信號下游調(diào)控的(AREG, IL1R2, S100A8,S100A9,IL10)，這種經(jīng)典單核細胞向MDSC樣抑制細胞的轉(zhuǎn)變可能源于強烈的IFN-I反應(yīng)。此外，該項研究的連接體分析強調(diào)了增強的TIM-3/Gal-9環(huán)路，這可能有助于異常的調(diào)控髓系特征。這種過早地轉(zhuǎn)向緩解期可能會中斷適當?shù)目共《久庖叻磻?yīng)，導(dǎo)致病毒清除延遲和在嚴重COVID-19中觀察到的有害臨床表現(xiàn)。

6.在進展期患者中，CD8⁺ T細胞表現(xiàn)出增強的效應(yīng)信號

接下來，該項研究嘗試檢測不同疾病條件下CD8⁺ T細胞亞群的基因表達差異。詳細分析子集19458個CD8⁺ T細胞顯示在穩(wěn)定型和進展期患者之間有明顯的區(qū)分, 這主要是由于進展期患者中ISGs 的高表達, 也可以通過效應(yīng)細胞因子如GZMB的高表達來顯示。大多數(shù)來自IFN激活的CD8⁺ T細胞簇的細胞位于進展期部分，并與效應(yīng)T細胞簇重疊?；虮磉_譜從早期時間點A到晚期時間點B有明顯的變化，主要是由ISG信號的減少驅(qū)動的。后續(xù)研究表明共抑制受體LAG3在進展患者的T淋巴細胞中表達增加，而其配體(MHC-II分子)在抗原提呈細胞中表達減少。

7.托珠單抗的作用因細胞類型而異，并與IL6R和IL6ST水平相關(guān)

10名COVID-19患者中有8名接受了抗IL-6受體(IL-6R)抗體托珠單抗治療。該項研究進一步研究了與托珠單抗治療相關(guān)的差異基因表達模式。IL6R在單核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、CD4⁺ T細胞(包括FoxP3調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs))和原始CD8⁺ T細胞中高表達。另一方面，IL6R在其他類型的淋巴細胞中表達較低，包括記憶性CD8⁺、效應(yīng)性CD4⁺和CD8⁺ T細胞，gamma-delta T細胞，B細胞和NK細胞。IL6ST(編碼gp130)負責IL-6與IL-6R結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在所有類型的PBMCs中都有表達。為了確定托珠單抗治療對COVID-19患者的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，該項研究比較了托珠單抗治療組與未接受托珠單抗治療組患者從A到B時間點的基因表達變化。該項研究重點研究了6個與IL-6通路相關(guān)的托珠單抗應(yīng)答基因(ARID5A, BCL3, PIM1, SOCS3, BATF, MYC)，已知它們在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中會被托珠單抗干擾。值得注意的是，托珠單抗的這些轉(zhuǎn)錄變化主要在高表達IL6R和IL6ST的細胞類型中觀察到，如初始CD4⁺ T細胞、記憶CD4⁺ T細胞、初始CD8⁺ T細胞和調(diào)節(jié)細胞。為了量化這一效應(yīng)，該項研究進行了IL-6評分(上述6種托珠單抗應(yīng)答基因的綜合評分)。該項研究發(fā)現(xiàn)，所有接受托珠單抗治療的患者CD4⁺ T細胞中IL-6評分顯著下降，而未接受托珠單抗治療的患者沒有下降。

接下來，該項研究試圖識別在COVID-19患者中被托珠單抗干擾的其他基因。為了盡可能減少疾病相關(guān)基因表達隨時間變化的混雜效應(yīng)，該項研究重點研究了非托珠單抗組中基因表達沒有隨時間變化而下降，但在托珠單抗治療后顯著下降的基因。該項研究證明，在大多數(shù)細胞類型中，托珠單抗治療后S100A8和S100A9的表達高度下調(diào)，但在非托珠單抗組中未發(fā)生變化，甚至略有升高。鑒于S100A8/9和IL-6之間存在一個正向前饋回路，可以驅(qū)動促炎癥通路，血清S100A8/9升高是COVID-19重癥患者的標志之一，托珠單抗可能通過抑制COVID-19中S100A8/9的表達來發(fā)揮作用。有趣的是，IL6R在髓系細胞中的表達高于IL6ST，而在其他所有細胞類型中的表達都低，導(dǎo)致IL6R/IL6ST比值的差異。根據(jù)最近的一項研究，這個比例決定了對IL-6信號的反應(yīng)類型，在具有高IL6R/IL6ST的細胞中抗炎經(jīng)典信號(在該項研究的髓細胞中觀察到)或在低IL6R/IL6ST的細胞中促炎反式信號(非髓系細胞)，可能解釋了觀察到的細胞類型對托珠單抗反應(yīng)的差異。雖然該項研究在細胞水平上檢測到對托珠單抗的反應(yīng)，但該項研究的研究既不是設(shè)計的，也不是為了檢測治療的任何臨床效果。盡管如此，這些基因表達模式可能表明COVID-19患者中托珠單抗效應(yīng)、IL6R、IL6ST和S100A8/9之間存在關(guān)聯(lián)。

8.COVID-19外周血細胞表面蛋白免疫表型研究

接下來，該項研究使用CITE-seq構(gòu)建了一個獨立的PBMCs免疫表型圖譜。為了更好地識別細胞多聯(lián)體，使該項研究能夠?qū)⒓毎撦d到10X平臺上，該項研究使用細胞哈希技術(shù)，在每個10X反應(yīng)中復(fù)用5-6個樣品。該項研究采用189個寡核苷酸標記的抗體。從下游分析中去除樣本來源不明的多片段和細胞，83.2%的細胞進行分析(n=43,349)在無監(jiān)督聚類之后，通過使用手工管理的標記基因列表，對CITE-seq細胞進行基因表達和抗體來源計數(shù)(ADT)注釋。該項研究觀察到一組未確定的細胞(n= 8032)，它們的ADT信號的多個譜系標記呈陽性，并且/或顯示出不太可能用免疫學證據(jù)解釋的信號升高 。這些細胞從分析中移除，所有其他細胞繪制在UMAP空間上。為了研究兩種注釋的一致性，該項研究計算了RNA注釋和ADT注釋的細胞類型之間共享細胞的百分比。

9.進展期患者HLA-DR⁺CD38⁺ T細胞表達更高的共抑制受體

重疊的細胞類型中,該項研究發(fā)現(xiàn)49%的ADT注釋激活效應(yīng)T細胞集群(HLA-DR⁺CD38⁺)與GEX重疊劃分T/NK集群, HLADRA / CD38和MKI67標志著獨特的T細胞在COVID-19亞群。HLA-DR和CD38的雙重表達或Ki67的高表達被認為是急性病毒感染中高度活化的T細胞群的標志。該項研究觀察到在COVID-19患者中，GEX分裂T/NK集群中表達MKI67的TCR⁺ T細胞增加，這一結(jié)果通過流式細胞術(shù)在相同樣本和不同隊列中進一步驗證，特別是在進展期患者的CD4⁺ T細胞中.最近一項對大量COVID-19患者使用流式細胞術(shù)的研究支持了這一觀察結(jié)果。

CITE-seq技術(shù)進一步使該項研究能夠闡明這些活化的T細胞群的轉(zhuǎn)錄特征。與其他T細胞簇相比，HLA-DR⁺CD38⁺ T表達共抑制受體(LAG3、CTLA4、PDCD1、ENTPD1、HAVCR2)，初始/干細胞標志物(TCF7、LEF1)和細胞毒性T細胞標志物(NKG7、KLRG1、PRF1、GZMH)表達較低。促進T細胞衰竭的轉(zhuǎn)錄因子(TFs) (PRDM1, MAF)也在該集群中富集。這些數(shù)據(jù)表明，在這一簇的T細胞顯示扭曲的轉(zhuǎn)錄標志向終末分化。

接下來，該項研究確定了這種活化的T細胞簇在穩(wěn)定期和進展期COVID-19患者之間是否存在轉(zhuǎn)錄差異。進展期患者IFN-I應(yīng)答基因(MX1, IRF7, ISG20)和細胞毒性/促炎細胞因子(PRF1, GZMH, IFNG)表達較高，干細胞/祖細胞標志物(TCF7, LEF1)表達較低。有趣的是，大多數(shù)共抑制受體在進展期患者(LAG3, CTLA4, HAVCR2)中富集，一些在穩(wěn)定期患者中富集(PDCD1, TIGIT)。衰竭/效應(yīng)驅(qū)動TFs (PRDM1, MAF)和在衰竭T細胞中表達的免疫調(diào)節(jié)細胞因子IL10在進展性患者中上調(diào)。該項研究發(fā)現(xiàn)，在進展期COVID-19患者激活的T細胞中，LAG-3是上調(diào)最多的共抑制受體，這一結(jié)果通過流式細胞術(shù)對不同隊列的COVID-19患者進行了驗證。考慮到共同抑制受體的高表達標志著T細胞耗竭和最近的研究表明在COVID-19的T細胞中觀察到類似衰竭的基因表達模式，該項研究試圖通過基因集富集分析(GSEA)來確定這些分裂的T細胞在進展患者中的基因表達特征。與穩(wěn)定期患者相比，進展期患者的T細胞分裂表現(xiàn)出更多的終末耗竭T細胞信號和IFN-I反應(yīng)信號。進展期COVID-19患者的轉(zhuǎn)錄特征與進展期與對照的HIV特異性T細胞的轉(zhuǎn)錄特征重疊。盡管在病毒感染的急性階段觀察T細胞衰竭還為時過早，但考慮到IFN-I通路在腫瘤浸潤T細胞和慢性病毒感染中都促進了T細胞衰竭，該項研究的數(shù)據(jù)表明，進展期COVID-19患者更強或更長時間的IFN-I反應(yīng)可能會促進T細胞提前分化。

據(jù)這些觀察，該項研究進一步試圖了解穩(wěn)定和進展患者之間免疫細胞相互作用的變化。在LAG-3配體中，該項研究觀察到進展期COVID-19患者骨髓細胞和B細胞上的MHC-II分子顯著減少，這也在該項研究對進展期與穩(wěn)定期COVID-19患者的差異分析中得到了證實。流式細胞術(shù)分析顯示CD4⁺ T細胞上的LAG-3與CD14⁺ 經(jīng)典單核細胞上的HLA-DR呈負相關(guān)，提示LAG-3/MHC-II相互作用的改變可能在疾病進展中發(fā)揮作用。

總之，該項研究的scRNA-seq分析和流式細胞術(shù)驗證顯示在COVID-19患者中，激活的T細胞數(shù)量增加，LAG-3的表達更高。此外，對這一人群的轉(zhuǎn)錄分析顯示，在進展期COVID-19患者中共抑制受體表達較高，并且出現(xiàn)了一個終分化的T細胞樣特征。T細胞和抗原提呈細胞之間不平衡的LAG-3/MHC-II相互作用可能反映了固有適應(yīng)性細胞相互作用的失敗，導(dǎo)致細胞毒性細胞因子的異常表達，進而可能導(dǎo)致免疫病理的變化。

10.進展期患者CD8⁺ T細胞的T細胞受體庫出現(xiàn)偏差

為了鑒定與SARS-CoV-2免疫相關(guān)的T細胞受體(TCR)，該項研究對COVID-19和對照樣本進行了單細胞V(D)J分析。總共捕獲67393個細胞的TCR數(shù)據(jù)，每個樣本的中位數(shù)為1954個細胞。數(shù)據(jù)質(zhì)量評估和控制過濾出8303個細胞，每個樣本中位數(shù)為1778個細胞。基于這些高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，來自同一受試者的具有相同的β和α鏈V(D)J序列的細胞被分組為克隆?？偣灿?1,742個唯一克隆被鑒定，平均每個樣本有1297個克隆。

使用Alakazam R包計算記憶CD4⁺ T細胞和初始CD4⁺ T細胞以及記憶和初始CD8⁺ T細胞的Alpha多樣性和稀疏性。進展期患者的記憶和初始CD8⁺ T細胞在兩個時間點的多樣性均低于穩(wěn)定期患者，這與進展期患者CD8⁺ T細胞克隆擴增較高是一致的。這種alpha多樣性的差異在記憶和初始CD4⁺ T細胞中沒有觀察到。進展期和穩(wěn)定期患者在A、B時間點CD4⁺ 和CD8⁺ T細胞克隆豐富度和均勻度的變化無明顯差異，可能是進展期患者在兩個時間點均有數(shù)據(jù)的數(shù)量較少所致。

11.COVID-19特異性CDR3區(qū)識別

為了識別可能賦予SARS-CoV-2特異性的TCR區(qū)域特征，該項研究使用GLIPH2評估COVID-19患者的互補決定區(qū)3(CDR3)序列的相似性。該項研究專門在β鏈中尋找CDR3基序，這些基序在幾個COVID-19患者中共享，但在13名對照組中沒有。嚴格的過濾器應(yīng)用于GLIPH2 CDR3特異性組(或簇)以提高準確性，特異性組有大于3個獨特的TCR，顯著的 V-gene 偏倚(p<0.05)。篩選的特異性組與對照樣本的任何克隆都被過濾掉，以增強對SARS-CoV-2的特異性，而不是對巨細胞病毒等其他常見病毒的特異性。經(jīng)重度過濾后，CD8⁺ 和CD4⁺ T細胞分別為24組和172組。大多數(shù)鑒定的特異性組包括來自不同樣品的克隆，表明潛在的SARS-CoV-2特異性克隆的CDR3序列有很大的相似性。為了進一步增強對克隆擴增的SARS-CoV-2應(yīng)答T細胞的特異性，該項研究重點研究了來自3名受試者的10個CD8⁺ 和12個CD4⁺ T細胞組，其中至少有一個克隆含有2個細胞。使用V和J基因分析顯示強大的J基因偏誤在3個CD8⁺ 組和1個CD4⁺ 組。一些VJ組合顯示主要使用如TRAV5/TRAJ12 /TRBJ2-7/TRBV5-6對簇1的使用占主導(dǎo)地位。CD4⁺ T組V基因使用無明顯偏倚，J基因使用以TRBJ2-5為主

在10個和12個假定的SARS-CoV-2特異性和擴展組中，該項研究進一步選擇了來自大于等于3個不同COVID-19患者的克隆，其中大于等于55%的克隆具有一個以上的細胞，從而分別形成5組和2組CD8⁺ 和CD4⁺ T細胞。選擇的集群也是前5和前2克隆集群，GLIPH2的組成分數(shù)最好，它衡量了基于全球/局部相似性的特異性組的強度，常見V基因的富集，有限的CDR3長度分布，擴展克隆(ECs)和集群大小。這表明所選擇的特異性組可能來自SARS-CoV-2特異性ECs，并在COVID-19患者中共享，具有高度保守的CDR3氨基酸(AA)序列。所有特異性組都是基于CDR3區(qū)域的全局相似性來確定的，除了CD8⁺ T細胞中的cluster IV，其成員克隆具有不同的CDR3長度，但具有相同的模體QDIG。具有全局相似性的特異性組的CDR3序列基序。該項研究證實了該項研究的樣本不受HLA基因型的影響。CDR3基序與最近兩項采用TCR表數(shù)據(jù)的SARS-CoV-2研究中發(fā)現(xiàn)的CDR3基序進行了比較，這些研究主要收集的樣本來自于SARS-CoV-2的恢復(fù)期和恢復(fù)期患者。結(jié)果顯示，該項研究的CD8⁺ 特異性組V motif (TNTGE)與Schulthei?等發(fā)現(xiàn)的TGTGE motif (TGTGE)具有相似的模式。該研究沒有在SARS-CoV-2康復(fù)患者共享的前31個模體中發(fā)現(xiàn)該模體，但發(fā)現(xiàn)在疾病活動性期間以及從一名輕度疾病患者和康復(fù)患者的恢復(fù)過程中，該模體在縱向樣本中共享，這表明該模體對SARS-CoV-2具有特異性。這種重疊驗證了該項研究的CD8⁺ 組 V模體對SARS-CoV-2感染的特異性。在活躍性疾病期間的樣本采集和排除對照樣本中存在的特異性組的GLIPH2分析也證明了該項研究的TCR分析的重要性。

12.單細胞V(D)J B細胞受體庫分析

每個樣本的細胞數(shù)、每種B細胞類型(初始B細胞、記憶B細胞、漿細胞)的頻率、每種同型(IGHM/D/G/A)的頻率分別匯總?？偟膩碚f單細胞V(D)J文庫包含7177個細胞，分布在18個樣品中。

13.狀態(tài)穩(wěn)定的COVID-19患者突變頻率較高，CDR-H3長度較長

COVID-19患者的IGHV/IGHJ突變頻率和CDR-H3長度因抗體類型和細胞類型不同而不同。IGHM記憶細胞和血漿B細胞的突變頻率顯著低于5%，無論治療或疾病進展組。正如所料，IGHG記憶B細胞和漿細胞的突變頻率高于IGHM細胞。特別是穩(wěn)定且未接受治療的COVID-19患者漿細胞突變頻率明顯高于5%。穩(wěn)定患者在托珠單抗治療下的記憶細胞有更高的突變頻率。

IGHG和IGHM的B細胞的CDR-H3長度一般在10到20 AAs之間變化(該項研究使用15 AAs作為下游比較)。然而,IGHG漿細胞的CDR-H3長度在COVID-19穩(wěn)定患者中明顯大于15AAs;而IGHG記憶細胞的CDR-H3長度與15個AAs沒有顯著差異。平均而言，穩(wěn)定的非托珠單抗患者的IGHG漿細胞CDR-H3長度大于穩(wěn)定的托珠單抗治療患者。

14.接受治療的穩(wěn)定患者CDR-H3氨基酸使用量沒有變化

該項研究試圖調(diào)查兩個抽血時間點(A和B) CDR-H3 AA使用的差異。該項研究通過計算CDR-H3段中每個AA在時間點B相對于時間點A的條件信息內(nèi)容(IC)來處理這個問題。該項研究平均了三個不同組患者的ICs條件:(1)未接受治療的穩(wěn)定患者;(2)托珠單抗治療的進展型患者(托珠單抗-進展型);(3)托珠單抗治療下病情穩(wěn)定的患者(托珠單抗-穩(wěn)定型)。研究的結(jié)果表明，AA在托珠單抗-穩(wěn)定型患者中的使用情況與其他組相當不同。事實上，托珠單抗-穩(wěn)定型患者的IGH指標在各時間點之間對CDR-H3段特異性AAs使用的偏好沒有任何變化。相反，進展期和非穩(wěn)定期患者的IC分布在不同的AAs中是不同的。特別是，相對于A，進展期和不穩(wěn)定期的患者在B時點丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)和酪氨酸(Y)的使用量增加，脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)和蘇氨酸(T)的使用量減少。

15.在COVID-19中的高頻率的漿細胞擴增克隆譜系

為了探究COVID-19患者的抗原驅(qū)動B細胞應(yīng)答，該項研究研究了擴展克隆譜系。該項研究鑒定了20個擴展克隆(ECs)，采用了來自15/18的樣本，包含1157/7177個細胞(占所有B細胞的16%)。在ECs中漿細胞顯著富集。TP7A和TP7B樣品不含漿細胞。在托珠單抗-穩(wěn)定型患者的ECs中，在托珠單抗-穩(wěn)定型的ECs中，IGHG細胞顯著富集，在托珠單抗-進展型的ECs中，IGHM細胞顯著富集

該項研究進一步研究了ECs內(nèi)細胞的突變頻率和CDR-H3長度。該項研究觀察到，無論治療狀態(tài)如何，穩(wěn)定患者的IGHG漿細胞的突變頻率平均高于進展患者。穩(wěn)定患者IGHG漿細胞的CDR-H3長度明顯大于15個AAs。特別是，未接受治療的患者比接受治療的患者有更大的平均CDR-H3長度。進展期患者IGHG漿細胞的CDR-H3長度明顯短于15個AAs。

在其他抗病毒反應(yīng)中已觀察到針對特定抗原選擇特定IGHV基因，例如針對某些流感病毒抗原選擇IGHV1-69基因。因此，該項研究試圖在COVID-19患者中篩選IGHV基因。IGHV4-34基因在穩(wěn)定患者的ECs中使用較多，治療組的優(yōu)勢比為~10，未治療組的優(yōu)勢比為~9.5。進展期患者使用IGHV4-34較低，優(yōu)勢比為~5.9。該項研究進一步對擴展的B細胞克隆進行了IGHV基因使用的主成分分析(PCA)。該項研究已經(jīng)確定了一組正在治療的患者，包括穩(wěn)定和進展的患者，其對應(yīng)的ECs只包含IGHV1-46(100%在TS4B)， IGHV3-21(100%在TS2B)， IGHV3-30-3(85%在TS3A)和IGHV3-72(100%在TP6A)。

16.未突變的IGHG克隆和SHM頻率穩(wěn)定的大量克隆是嚴重COVID-19的特征

BCR序列分析可以為研究COVID-19內(nèi)B細胞的反應(yīng)動力學提供重要信息。先前的工作證明與健康對照組相比，COVID-19患者中未突變的IGHG B細胞克隆比例更高。這可能是初級免疫反應(yīng)中GC進入前早期類切換的跡象。該項研究同樣觀察到，考慮到擴增克隆和未擴增克隆，每個患者中有0% - 45.7%的IGHG克隆未突變。此外，與進展期患者相比，穩(wěn)定期患者未突變的IGHG克隆比例更高，盡管這種差異不顯著。最近的一項分析表明，這種未突變的胞漿細胞的擴增是住院的COVID-19患者的特征，而不是有輕微癥狀的患者。這些克隆主要由記憶細胞和漿細胞組成，而IGHM克隆主要由IGHM細胞組成。該項研究還觀察到多個不同的B細胞克隆，包括擴展的和非擴展的，跨越兩個時間點。為了描述這些克隆的潛在親和性，該項研究為所有克隆建立了至少包含三個序列的B細胞系統(tǒng)發(fā)育樹，這些序列要么是不同的，要么是在不同的時間點發(fā)現(xiàn)的。該項研究在時間點A觀察到這些克隆中SHM水平相對較高。然后，該項研究使用系統(tǒng)發(fā)育的根尖相關(guān)檢驗來確定這20個克隆從種系序列的差異是否在A和B時間點之間增加。樣本時間與序列共同祖先的差異無顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，在這些克隆中缺乏可測量的時間點SHM積累。綜上所述，觀察到的未突變的漿細胞的擴張和可測量的B細胞進化的缺乏與之前的研究一致，可作為COVID-19住院患者中生發(fā)中心反應(yīng)中斷的證據(jù)。

17.在COVID-19患者中引發(fā)聚合性抗體重排

該項研究在8名患者中發(fā)現(xiàn)了19個聚集性抗體簇。79%(15/19)的聚集性簇包括來自托珠單抗-穩(wěn)定型患者的抗體，47%(9/19)包括來自非托珠單抗穩(wěn)定患者的抗體，31%(6/19)的聚集性簇包括來自托珠單抗-進展型患者的抗體。接下來，該項研究將重點放在托珠單抗-穩(wěn)定型的患者身上，這些患者在最集中的群體中有代表性。該項研究確定了6個聚集性簇，僅由托珠單抗-穩(wěn)定型患者組成。這些抗體聚集在兩名患者之間，由IGHV1-46/IGHJ3、IGHV3-23/IGHJ6、IGHV3-33/IGHJ6、IGHV3-48/IGHJ3、IGHV4-59/IGHJ6、IGHV5-51/IGHJ4基因組成。

總之，該項研究的多組學單細胞分析顯示，在托珠單抗治療下，COVID-19表現(xiàn)穩(wěn)定和進展的患者發(fā)生了動態(tài)免疫反應(yīng)。該項研究全面的免疫分析強調(diào)了COVID-19中巨大的IFN-I反應(yīng)以及非同步的適應(yīng)性和先天免疫相互作用?；虮磉_和表面蛋白聯(lián)合分析揭示了進展患者中活化T細胞亞群的超IFN-I反應(yīng)。在活化的T細胞中，過度的調(diào)節(jié)性固有免疫反應(yīng)和獨特的共抑制受體表達是疾病進展的標志。在COVID-19患者中發(fā)現(xiàn)了CD8⁺ T細胞的傾斜T細胞庫和獨特的富集VDJ序列。在SARS-CoV-2感染急性期，沒有獲得體細胞高突變的漿細胞擴增與早期原發(fā)性和/或濾泡外反應(yīng)相一致。最后，該項研究描述了對托珠單抗的細胞反應(yīng)，包括大多數(shù)細胞類型中托珠單抗治療患者中S100A8/9的表達下降。

總結(jié)：

該項研究的實驗設(shè)計使該項研究能夠確定:

• (1)COVID-19免疫反應(yīng)隨時間的動態(tài)變化
• (2)COVID-19患者的一般免疫細胞特征
• (3)進展性疾病相關(guān)的特異性免疫信號
• (4)利用T細胞和B細胞庫分析深入探討COVID-19的適應(yīng)性免疫
• (5)托珠單抗的治療效果

該項研究的無偏系統(tǒng)生物學方法利用新的多模態(tài)單細胞分析技術(shù)揭示了這種疾病的免疫反應(yīng)的時間動力學。它突出了區(qū)分穩(wěn)定型和進展型COVID-19患者的獨特免疫特征。該研究中的免疫網(wǎng)絡(luò)特征，提高了對在嚴重疾病中促進病理的豐富的細胞相互作用和影響的理解，包括先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的非同步化。

總的來說，該項研究全面的免疫分析強調(diào)了在進展期COVID-19中先天性和適應(yīng)性免疫相互作用的不同步，這可能導(dǎo)致病毒清除的延遲。對嚴重COVID-19免疫細胞圖譜的高分辨率理解將增強該項研究開發(fā)免疫調(diào)節(jié)治療方法的能力，以防止COVID-19患者病情進一步進展。

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