CRISPR-Cas9被認為是一種革命性的基因編輯工具，但由于缺乏安全有效地將其導(dǎo)入細胞的方法，其應(yīng)用受到限制。最近，一個研究團隊使用胺化聚輪烷（PRX）構(gòu)建了一種高度靈活的CRISPR-Cas9載體，該載體不僅可以與Cas9的異常結(jié)構(gòu)結(jié)合并攜帶到細胞中，還可以保護其免受內(nèi)體的細胞內(nèi)降解。

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）及其伴隨的蛋白質(zhì)CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）作為一種改變游戲規(guī)則的基因組編輯系統(tǒng)，幾年前成為國際頭條新聞。該系統(tǒng)由Cas9和一條被稱為單導(dǎo)向RNA（sgRNA）的遺傳物質(zhì)鏈組成，可以針對DNA的特定區(qū)域，起到“分子剪刀”的作用，進行精確編輯。Cas9-sgRNA復(fù)合物，即Cas9核糖核蛋白（RNPs）直接進入細胞核被認為是實現(xiàn)基因組編輯的最安全、最有效的方法。然而，Cas9 RNP的細胞通透性較差，因此需要一個載體分子將其運輸穿過細胞膜的第一道障礙，然后才能到達細胞核。這些載體需要與Cas9 RNP結(jié)合，將其攜帶到細胞中，防止其被稱為“內(nèi)體”的細胞內(nèi)細胞器降解，并最終釋放，而不會對其結(jié)構(gòu)造成任何改變。

在2022年6月發(fā)表在《今日應(yīng)用材料》第27卷的最新論文中，熊本大學(xué)的一個研究團隊開發(fā)了一種可轉(zhuǎn)化的聚輪烷（PRX）載體，該載體可以利用Cas9RNP高效、易用地進行基因組編輯。“雖然之前已經(jīng)有一些基于PRX的核酸和蛋白質(zhì)藥物載體的報道，但這是第一篇關(guān)于基于PRX的Cas9 RNP載體的報道。此外，我們的發(fā)現(xiàn)描述了如何跨多個步驟精確控制細胞內(nèi)動力學(xué)。這將證明對這一方向的未來研究非常寶貴，”該論文的通訊作者Keichi Motoyama教授說。

對于他們的新型載體，研究團隊專注于含有胺基的PRX，即氨基PRX，并在獲得最終產(chǎn)品之前進行了多輪開發(fā)和優(yōu)化。例如，第一代（1G）載體分子利用氨基PRX的自主轉(zhuǎn)化特性，有效地將其與Cas9 RNP復(fù)合，并使其能夠通過細胞膜傳遞。第二代（2G）致力于內(nèi)體逃逸。這是通過將氨基PRX中的氨基轉(zhuǎn)化為內(nèi)小體內(nèi)的高度陽離子（帶正電）粒子實現(xiàn)的，這導(dǎo)致內(nèi)小體破裂和Cas9 RNP氨基PRX逃逸。接下來的幾代人解決了Cas9一旦逃離內(nèi)體后釋放的相關(guān)問題。最后，他們開發(fā)了第五代（5G）多步可轉(zhuǎn)化氨基PRX載體，該載體可以精確有效地將Cas9 RNP運送到細胞核中。研究團隊進一步進行了體外和體內(nèi)實驗，以確認該系統(tǒng)的細胞毒性及其基因組編輯效率。熊本大學(xué)副教授Taishi Higashi透露：“我們的輸送系統(tǒng)細胞毒性低，其基因組編輯活性相當于目前市場上最有效的系統(tǒng)?！彼窃撗芯康牧硪晃煌ㄓ嵶髡??！按送猓覀冊趲状酥g優(yōu)化輸送系統(tǒng)的多次嘗試，提供了關(guān)于各種可生物降解基團和氨基的類型和位置的重要信息，可用于此類系統(tǒng)，以進一步定制和調(diào)整其性質(zhì)?！?/span>

5G氨基PRX載體的自主作用、多步轉(zhuǎn)化特性和低細胞毒性使其成為安全高效地遞送Cas9 RNP的極有希望的候選載體。這些發(fā)現(xiàn)還可以應(yīng)用于廣泛的分子傳遞，如酶、抗體和小干擾RNA（siRNA），從而使這種新型載體在藥物和疫苗開發(fā)領(lǐng)域取得重大成就。

Toru Taharabaru, Takuya Kihara, Risako Onodera, Tetsuya Kogo, Kenjirou Higashi, Kunikazu Moribe, Teruya Nakamura, Keiichi Motoyama, Taishi Higashi. Polyrotaxane-based multi-step transformable materials for the delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Applied Materials Today, 2022; 27: 101488 DOI: 10.1016/j.apmt.2022.101488

https://www./science/article/abs/pii/S2352940722001238?via%3Dihub#fig0007