在全球范圍內(nèi)，肝臟腫瘤（肝細(xì)胞癌，HCC）發(fā)生率持續(xù)增加，成為危害公共健康的重要因素[1]。有預(yù)測顯示，在2025年以前，每年將有超過一百萬新增HCC患者[2]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年我國HCC發(fā)生率高居世界第八位，而在我國所有癌癥中，HCC發(fā)病率位居第五位，死亡率位居第二位，HCC的防控及治療刻不容緩！

在過去的五年中，免疫檢查點抑制劑（ICI）為HCC治療帶來了巨大的變革。相較于傳統(tǒng)的HCC一線治療藥物索拉非尼，多種聯(lián)合治療方案，如阿替利珠單抗（PD-L1）和貝伐珠單抗（VEGF-A）的聯(lián)合治療、度伐利尤單抗（PD-L1）和Tremelimumab（CTLA-4）的聯(lián)合治療、阿替利珠單抗和Cabozantinib（多靶點酪氨酸酶抑制劑）的聯(lián)合治療等等，均取得了更好的治療效果。除此之外，納武利尤單抗（PD-1）和伊匹木單抗（CTLA-4）的聯(lián)合治療方案、帕博利珠單抗（PD-1）的單一治療方案更是因其出色的早期臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)入美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的快速審批通道[3]。

然而，亞洲的HCC患者對ICI治療方案的客觀響應(yīng)率（ORR）并不理想[4]，因此，了解HCC免疫抑制微環(huán)境具有極其重要的意義，如何打破免疫治療耐受，并開發(fā)新型免疫治療方案成為重中之重。

近日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系朱棣，以及復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐泱團(tuán)隊合作，在著名期刊Cancer Discovery發(fā)表重要研究成果。

他們利用HCC患者的臨床研究和小鼠HCC模型，發(fā)現(xiàn)干擾素（IFN）-α通過調(diào)控HCC細(xì)胞中FosB的轉(zhuǎn)錄活動，抑制缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α，從而抑制HCC細(xì)胞糖酵解，降低對葡萄糖的攝取，重塑并形成富含葡萄糖的腫瘤微環(huán)境（TME）；高葡萄糖的TME 促進(jìn)T細(xì)胞mTOR-FOXM1信號通路活化，使腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞高表達(dá)共刺激分子CD27，增強(qiáng)其殺傷功能，放大PD-1阻斷對HCC的治療效果[5]。更重要的是，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案在HCC患者中具有較高的響應(yīng)率，并顯著抑制HCC的疾病進(jìn)展。 

他們的研究成果為開辟HCC新型免疫治療方案提供了堅實可靠的理論基礎(chǔ)，其取得的前期臨床試驗成果令人興奮不已！復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胡博主治醫(yī)師、中山醫(yī)院喻敏成博士研究生、中山醫(yī)院馬曉路博士、中山醫(yī)院孫嘉磊博士研究生、藥學(xué)院劉成龍博士研究生為該文共同第一作者。

接下來咱們就一起看看，樊嘉院士/朱棣/徐泱團(tuán)隊是如何探索IFN-α+PD-1阻斷對HCC的治療效果及其背后的免疫學(xué)機(jī)制。

IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療顯著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展

為了觀察IFN-α+PD-1阻斷的聯(lián)合治療效果，研究人員觀察了15例無法進(jìn)行手術(shù)切除的肝癌患者，并給予IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療。令人驚訝的是，聯(lián)合治療后ORR為40.0%，疾病控制率（DCR）高達(dá)80.0%，同時沒有出現(xiàn)因治療導(dǎo)致的死亡病例。

其中1號患者是一名67歲的女性，曾做過動脈插管化療栓塞術(shù)（TACE），并隨后接受PD-1阻斷治療，但是臨床反應(yīng)較小，最終導(dǎo)致疾病持續(xù)加重。該患者肝臟中最大的腫瘤 （2.3×4.1 厘米）位于 VIII 節(jié)段，靠近肝門靜脈分支。然而，經(jīng)過7周的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，該患者的腫瘤出現(xiàn)壞死，其體積顯著變小。在后期的隨訪觀察中，該患者的腫瘤大小也未增加，同時也沒有出現(xiàn)副作用。

2號患者是一名34歲的男性，其肝癌十分巨大。該患者經(jīng)過多次TACE治療和兩次肝切除，隨后也接受PD-1阻斷治療。在治療后的一年內(nèi)，該患者并未出現(xiàn)明顯的肝癌復(fù)發(fā)跡象。但兩年后，該患者出現(xiàn)呼吸困難的癥狀，經(jīng)CT檢測發(fā)現(xiàn)，肺臟出現(xiàn)10個以上的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。值得慶幸的是，經(jīng)過兩個月的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，CT檢測發(fā)現(xiàn)該患者肺臟中的多個腫瘤轉(zhuǎn)移灶被完全清除，同時最大的腫瘤結(jié)節(jié)（1.4厘米）顯著縮小，也沒有出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶。

IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療促進(jìn)CD27+CD8+T細(xì)胞比例

為了探究IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案的免疫學(xué)機(jī)制，研究人員利用肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞和H22細(xì)胞構(gòu)建原位同基因小鼠肝癌模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于IFN-α或PD-1阻斷等單一治療，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時，荷瘤小鼠生存期明顯延長。更重要的是，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠誘導(dǎo)腫瘤壞死，進(jìn)而完全清除肺臟中的轉(zhuǎn)移灶。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療依賴健全的免疫系統(tǒng)，同時IFN-α直接作用于表達(dá)其受體（IFNAR1）的HCC細(xì)胞。

為了解IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療對TME中浸潤的免疫細(xì)胞的影響，研究人員分離腫瘤組織中的CD45+免疫細(xì)胞，并使用質(zhì)譜流式（CyTOF），檢測了42種細(xì)胞表面或胞內(nèi)的免疫指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著降低耗竭CD8+T細(xì)胞前體的數(shù)量。

接下來，研究人員對Hepa1-6荷瘤小鼠進(jìn)行了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的清除實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在其中發(fā)揮了重要作用。結(jié)合CyTOF和多色免疫熒光的檢測結(jié)果，研究人員觀察到經(jīng)過IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，腫瘤組織中CD27+CD8+T細(xì)胞亞群的數(shù)量顯著增加。除此之外，研究人員將HCC患者培育的類器官（PDO）與自體的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，也觀察到了類似的現(xiàn)象，即IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理能夠在最大程度上增加CD8+T細(xì)胞上CD27的表達(dá)。

那么，CD27表達(dá)是否能夠促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能呢？為此，研究人員利用Cd27特異性的siRNA，敲低腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞上CD27的表達(dá)。與預(yù)期的一致，CD27下降后，CD8+T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒的能力顯著降低。同時，HCC患者腫瘤組織的單細(xì)胞測序結(jié)果也證實，CD27highCD8+T細(xì)胞上細(xì)胞毒性和增殖相關(guān)的基因表達(dá)水平也明顯增加。有趣的是，HCC患者腫瘤組織中的CD27highCD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)亦高于CD27lowCD8+T細(xì)胞。

以上結(jié)果暗示CD27+CD8+T細(xì)胞亞群可能在IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療的過程扮演了重要角色。

IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解

基因集富集分析（GSEA）和免疫印跡實驗均證實，阻斷PD-1會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中的HIF1α信號通路，然而，聯(lián)合治療則顯著抑制HIF1α信號通路。與腫瘤細(xì)胞相反的是，腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞在經(jīng)過PD-1阻斷后，HIF1α及其下游分子的表達(dá)有所下降，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理則會起到相反的結(jié)果，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞攝取葡萄糖的能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)其增殖和活化。

IFN-α通過IRF1-FosB信號軸負(fù)調(diào)HIF1α

HIF1α在糖酵解過程中發(fā)揮了重要作用，因此研究人員進(jìn)行了細(xì)胞外酸化率（ECAR）實驗。與HIF1α信號通路的變化一致，阻斷PD-1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理會顯著抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解。在CD8+T細(xì)胞中得到了截然相反的結(jié)果。并且，阻斷PD-1后，TME中葡萄糖含量明顯降低，而IFN-α處理則會逆轉(zhuǎn)這一變化。

IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療活化mTOR-FOXM1信號通路

深入研究發(fā)現(xiàn)IFN-α處理會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子IRF1的表達(dá)，并使其向核內(nèi)聚集，繼而抑制促癌基因FosB的表達(dá)，而FosB會與HIF1α結(jié)合，導(dǎo)致HIF1α無法繼續(xù)促進(jìn)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，如Pfkl，Hk1，Pkm2和Ldha等等，最后造成腫瘤細(xì)胞糖酵解能力下降，形成葡萄糖含量變高的TME。

TME中葡萄糖含量越高，CD8+T細(xì)胞中p-mTOR、HIF1α、PKM2、LDHA和CD27等分子的蛋白水平越高，并且，這一過程依賴mTOR信號通路。為了研究mTOR對CD27的調(diào)控作用，研究人員利用信號通路計劃（SPP）數(shù)據(jù)庫，預(yù)測人白細(xì)胞中調(diào)控CD27的轉(zhuǎn)錄因子，并與單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。發(fā)現(xiàn)CD27highCD8+T細(xì)胞高表達(dá)FOXM1。雖然在穩(wěn)態(tài)下，CD8+T細(xì)胞過表達(dá)Foxm1，不能增加CD27+CD8+T細(xì)胞的比例，但會顯著促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2。

有意思的是，CD8+T細(xì)胞中FOXM1的表達(dá)在IFN-α處理后會明顯增加，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理則會進(jìn)一步放大這一現(xiàn)象。除此之外，高葡萄糖培養(yǎng)基也會促進(jìn)FOXM1表達(dá)。相反的是， mTOR抑制劑或HIF1α抑制劑則會逆轉(zhuǎn)FOXM1的表達(dá)。

隨后，研究人員用IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療荷瘤小鼠，并分離腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞，過表達(dá)和敲低實驗均證實FOXM1能夠促進(jìn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD27。除此之外，研究人員在HCC的TCGA數(shù)據(jù)庫和單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中也看到了類似的現(xiàn)象，即CD27和FOXM1表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)。

CD27和CD8是HCC患者良好預(yù)后的重要指標(biāo)

以上結(jié)果證實IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療會重塑TME，使得微環(huán)境中葡萄糖含量增加，激活CD8+T細(xì)胞中的mTOR信號通路，提高FOXM1表達(dá)水平，從而增強(qiáng)Cd27轉(zhuǎn)錄。

最后研究人員對HCC患者進(jìn)行生存期預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)CD27highCD8high的細(xì)胞越多，患者的無進(jìn)展生存期和總生存期越長，預(yù)后也越好。不僅如此， HCC患者經(jīng)過PD-1阻斷治療后，有響應(yīng)的患者往往存在更多的腫瘤浸潤C(jī)D27+CD8+淋巴細(xì)胞。

總的來說，樊嘉院士/朱棣/徐泱的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著抑制肝癌小鼠或HCC病人中的腫瘤生長。深入研究證實，IFN-α?xí)T導(dǎo)HCC細(xì)胞中IRF1表達(dá)，繼而抑制FosB轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HIF1α的轉(zhuǎn)錄活動被抑制，使得HCC細(xì)胞糖酵解能力下降，重塑TME。富含葡萄糖的TME又會活化CD8+T細(xì)胞的mTOR-FOXM1信號通路，導(dǎo)致共刺激分子CD27表達(dá)增加，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的腫瘤免疫監(jiān)視功能。

文章內(nèi)容總結(jié)圖

樊嘉院士及其團(tuán)隊任重而道遠(yuǎn)，他們設(shè)計的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案仍不成熟，比如，應(yīng)擴(kuò)大HCC臨床患者群體，以檢驗IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療的臨床價值；需要系統(tǒng)性評估該治療方案的不良反應(yīng)；同時，還應(yīng)探索IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療對其它類型腫瘤的治療效果。

但是，毫無疑問，樊嘉院士/朱棣/徐泱團(tuán)隊推出的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案振奮人心、令人激動！他們的初期臨床試驗和小鼠動物模型得到的效果也十分顯著、意義重大！希望后續(xù)的相關(guān)臨床試驗也同樣出色，為腫瘤的免疫學(xué)治療做出里程碑式的貢獻(xiàn)，也為廣大腫瘤患者帶來真正的希望！