研究背景

在真核生物發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互結(jié)合所驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)順式作用元件(cis-regulatory element, CRE)活力的動(dòng)態(tài)變化在細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中起中心作用。在單細(xì)胞的尺度上衡量染色質(zhì)開放性(例如scATAC-seq)有助于精確理解CRE的活性變化，尤其與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(scRNA-seq)相結(jié)合，可以幫助解析不同轉(zhuǎn)錄因子如何協(xié)同的調(diào)節(jié)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的發(fā)育過程。例如，人大腦皮層發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、高度調(diào)節(jié)的過程。位于室管膜區(qū)(ventricular zone, VZ)和室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)的放射狀膠質(zhì)(radial glia, RG)和中間前體細(xì)胞(intermediate progenitor cell, IPC)采用一種所謂的由內(nèi)向外(inside-out)的方式分化成興奮性神經(jīng)元，以及星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。而GABA能抑制性神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞以及一些少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生于背側(cè)前腦，然后遷移并整合進(jìn)大腦皮層。在單細(xì)胞尺度上精確理解大腦皮層發(fā)生中的基因表達(dá)調(diào)控必然需要同時(shí)在單細(xì)胞上研究染色質(zhì)開放性和基因表達(dá)水平。

方法流程

為了實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)研究，單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)軍人物，ATAC技術(shù)開發(fā)者William Greenleaf教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)孕期16周、20周、21周和24周的胎兒大腦皮層組織進(jìn)行單細(xì)胞研究，然后利用單細(xì)胞測(cè)序分析平臺(tái)做獨(dú)立的scRNA-seq和scATAC-seq，分別獲得57868個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和31304個(gè)單細(xì)胞表觀基因組。通過非監(jiān)督學(xué)習(xí)對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聚類分析；采用一個(gè)迭代算法^[1]對(duì)scATAC-seq結(jié)果進(jìn)行分析，得到可能作為CRE的657930個(gè)峰。作者采用典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis, CCA)算法^[2]對(duì)兩組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相互映射，得到64878個(gè)CRE-gene對(duì)，每一對(duì)CRE-gene可以代表每一個(gè)enhancer-gene的相互作用，最終得到185個(gè)可以根據(jù)染色質(zhì)開放程度預(yù)測(cè)表達(dá)水平的基因(genes with putative chromatin, GPCs)。在對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證之后，作者接下來分別分析了興奮性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子motif的活性的動(dòng)態(tài)調(diào)控。

研究結(jié)果

1. 人大腦皮層發(fā)育的單細(xì)胞調(diào)節(jié)圖譜

作者對(duì)孕期16周、20周、21周和24周的胎兒大腦皮層細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立的scRNA-seq和scATAC-seq，分別獲得57868個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和31304個(gè)單細(xì)胞表觀基因組。首先對(duì)scRNA-seq結(jié)果進(jìn)行UMAP聚類分析，同時(shí)對(duì)scATAC-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代分析，得到一個(gè)低維的包含657930個(gè) CRE峰的聚類?？傮w上來看，scRNA-seq和scATAC-seq的聚類是比較相似的，且主要和細(xì)胞類型以及孕周有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，皮層發(fā)生中幾個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，SOX9， EOMES， NEUROD2和DLX2均表現(xiàn)聚類特異的富集，證明了這樣的聚類分析是可靠的。

作者接下來對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)集根據(jù)已知的基因表達(dá)數(shù)據(jù)或基因活性數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，作者注釋到了分裂中的細(xì)胞(Cyc)、放射狀膠質(zhì)(RG)，其中RG根據(jù)在不同的樣本分布，可以分為早期RG(early RG)和晚期RG(late RG)，后兩者表達(dá)不同的標(biāo)志物。作者同樣注釋到多能前體細(xì)胞(multipotent glial progenitor cell, mGPC)、更多的神經(jīng)元中間前體細(xì)胞(neuronal IPC)以及興奮性神經(jīng)元(GluN)，以及部分小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等。作者注意到，很多標(biāo)志物基因在scATAC-seq的活性評(píng)分(gene activity score)是動(dòng)態(tài)變化的。

作者用典型相關(guān)分析(canonic correlation analysis, CCA)算法將基因活性評(píng)分和基因表達(dá)水平相整合，整合的結(jié)果顯示，除了Cyc細(xì)胞，其他cluster的類別前后是一致的。通過這種方式，作者分離出了64878個(gè)CRE-gene對(duì)，其中每一對(duì)CRE-gene代表可能的enhancer-gene相互作用關(guān)系。在這些CRE-gene對(duì)中，CRE的開放性和基因表達(dá)水平共同可以區(qū)分出每個(gè)cluster，并且這兩者是協(xié)同變化的。

接下來，作者對(duì)CRE-gene的相關(guān)性進(jìn)行排序，希望找到可以根據(jù)CRE的開放性來預(yù)測(cè)出該gene表達(dá)水平的基因。作者假設(shè)這些基因應(yīng)該是一群高度受調(diào)節(jié)的基因，并且在皮層發(fā)生過程中對(duì)細(xì)胞命運(yùn)起重要作用。作者取了前10%作為可以根據(jù)染色質(zhì)開放性預(yù)測(cè)表達(dá)的基因(genes with predictive chromatin, GPCs)，共185個(gè)。GO富集分析表明這些基因基本富集在和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的條目上(transcription regulator activity, DNA-bind TF activity)。

2.大腦皮層神經(jīng)元發(fā)生的連續(xù)軌跡分析

作者接下來對(duì)一群主要的細(xì)胞類型，興奮性神經(jīng)元(GluN)進(jìn)行進(jìn)一步的專門的發(fā)育軌跡分析 ，以期望找到神經(jīng)元特化、遷移和成熟過程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)。這里主要通過對(duì)scRNA-seq的擬時(shí)序分析來研究這個(gè)問題。作者首先通過其他數(shù)據(jù)驗(yàn)證了擬時(shí)序結(jié)果的可靠性，然后將擬時(shí)序的時(shí)間值賦予在scATAC-seq上最近鄰居的細(xì)胞以映射，獲得在scATAC-seq上一個(gè)連續(xù)的擬時(shí)序結(jié)果。同樣利用和之前一樣的CCA算法，在GluN上分離出13989對(duì)CRE-gene對(duì)，并且分為五大群。GO富集分析顯示，在擬時(shí)序上早期起作用的基因富集的條目包括細(xì)胞分裂和神經(jīng)元祖細(xì)胞分化，而晚期的基因富集在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、遷移和成熟。有趣的是，編碼轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合蛋白出現(xiàn)在中期。相反，作者同樣也找到了一些富集在早期和中晚期的DNA motif。

作者接下來研究了在擬時(shí)序上，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。作者觀察到首先是早期 的PAX6, SOX2/6/9, GLI3和 ASCL1的motif，然后是中期的EOMES, NF1A, NF1B, NEUROD1，最后是晚期的NEUROD2, BHLHE22, MEF2C，表明在神經(jīng)元發(fā)育過程中，DNA motif的時(shí)序激活。

作者通過計(jì)算基因組層面上的轉(zhuǎn)錄因子和DNA motif的協(xié)同性和相關(guān)性，想知道在皮層發(fā)生過程中，各轉(zhuǎn)錄因子是如何協(xié)調(diào)的。他們發(fā)現(xiàn)在擬時(shí)序上，存在三大類motif，早期的 motif是中度的協(xié)同，包括SOX，GLI，PAX，中間態(tài)的motif之間非常高的協(xié)同程度，包括NFI，TBX/EOMES，而晚期的motif呈現(xiàn)最不協(xié)同作用，包括NEUROD2，BHLHE22，MEF2。

3.基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)決定的關(guān)系：模塊分析

由于各膠質(zhì)細(xì)胞cluster基因表達(dá)存在一定的重疊，作者接下來采用了fuzzy c-means clustering (FCC)的方法來對(duì)各cluster進(jìn)行基因模塊的聚類和注釋。FCC方法得到了14個(gè)基因模塊，并且在擬時(shí)序上，樣本類型和之前的cluster都可以被每個(gè)基因模塊區(qū)分，每個(gè)基因模塊也富集不同的GO term。因此，這種模塊的分析讓作者有可能去研究不同模塊之間所包含的基因重疊的程度，而這種重疊程度有助于理解各cluster之間的發(fā)育分化關(guān)系。

采用這種方法，作者發(fā)現(xiàn)ASCL1+的表達(dá)m3和m8的細(xì)胞最終分化成EOMES+的nIPC細(xì)胞；HES4+的表達(dá)m6的細(xì)胞分化成星型膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞；ASCL1+/OLIG1+表達(dá)m12,m1,m4的細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)分支，表明ASCL1+/OLIG1+很可能是星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的共同前體細(xì)胞。

4.星型膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性分析

人皮層星型膠質(zhì)細(xì)胞存在很大的異質(zhì)性，但是異質(zhì)性是如何產(chǎn)生的至今不清楚。作者發(fā)現(xiàn)表達(dá)星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的m2，m13，m14 模塊存在相互聯(lián)系，提示這可能是研究上述問題的一個(gè)切入點(diǎn)。作者計(jì)算了m13、m14包含的基因和其enhancer的motif的富集程度，發(fā)現(xiàn)ASCL1和NHLH1在m13富集，而SOX21在m14富集。而ASCL1和NHLH1和OLIG1相關(guān)，因此，作者提出OLIG1和SOX21 motif的開放性不同即區(qū)分了不同的星型膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)模式。作者檢查了m2/m14和m13的不同的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前者高表達(dá)HES4和CAV2，后者高表達(dá)SPARCL1，ID3和IGFBP7，印證了存在星型膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞的異質(zhì)性。

5.GPCs和細(xì)胞命運(yùn)決定

作者探究祖細(xì)胞中的染色質(zhì)狀態(tài)如何決定下游細(xì)胞獲得不同表達(dá)模式從而獲得不同的細(xì)胞命運(yùn)。作者關(guān)注了表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因模塊的細(xì)胞病研究其異質(zhì)性。作者投射了13378個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞，同樣使用CCA算法，將染色質(zhì)開放性的數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。scATAC-seq鑒定出幾個(gè)不一樣的細(xì)胞分支，作者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)基因活性評(píng)分得到的每個(gè)分支的特異性基因均和GPCs有部分的重疊，包括HES1，RFX4，OLIG1，OLIG2，NEUROD6， EOMES。并且，總體上分裂細(xì)胞的三個(gè)分支的不同表達(dá)基因也在GPCs基因列表中富集。每一個(gè)分支在前五個(gè)特異基因(BHLHE40, OLIG1, OLIG2, NEUROD6, NEUROD4)中至少富集一個(gè)基因。這些結(jié)果表明染色質(zhì)的不同活力以及GPCs的表達(dá)水平?jīng)Q定了Cyc細(xì)胞向何種細(xì)胞類型分化。作者發(fā)現(xiàn)，在Cyc細(xì)胞中，GPC基因的染色質(zhì)模式已經(jīng)提前建立了，即進(jìn)入細(xì)胞周期的祖細(xì)胞已經(jīng)在表觀遺傳學(xué)上發(fā)生了命運(yùn)決定的修飾，并且特異性的由GPCs編碼。

研究結(jié)論

本研究結(jié)合scRNA-seq和scATAC-seq對(duì)四個(gè)時(shí)期的胎兒大腦皮層細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合分析，完成了人大腦皮層發(fā)生過程中各細(xì)胞類型的單細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控圖譜，發(fā)現(xiàn)了在皮層發(fā)生過程中，一系列可以通過染色質(zhì)開放性預(yù)測(cè)表達(dá)水平的基因，進(jìn)一步的深入研究，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化的路徑以及不同的轉(zhuǎn)錄因子在這些過程中的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在星型膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞中即存在異質(zhì)性。

參 考 文 獻(xiàn)