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導 讀 當前，高通量測序技術(shù)（NGS）在腫瘤基因突變檢測領域發(fā)揮著越來越重要的作用，但新技術(shù)的廣泛應用也給臨床檢測規(guī)范化帶來了新的挑戰(zhàn)。在規(guī)范化NGS實驗室建立和使用的過程中，首先需要考慮“人員”、“設備”、“物料”、“方法”以及“環(huán)境”五個要素，以保證每一例樣本檢測結(jié)果的準確性。 本篇推文主要從“環(huán)境”這一要素，介紹NGS實驗室的規(guī)范化布局以及基本儀器設備配置。 ※ 文章素材來源于李金明《高通量測序技術(shù)》。  目前已建成的分子檢測實驗室普遍存在的問題包括：房間布局不合理，房間空間利用率低；實驗室各區(qū)域內(nèi)通風設施效果不佳，無法有效清除“污染物”；房間溫濕度波動較大，影響儀器運行狀態(tài)；實驗室各區(qū)間壓力按區(qū)域順序梯度遞減等。 由于NGS檢測具有很高的靈敏度，在NGS檢測過程中，樣本源性污染、Index源性污染、擴增產(chǎn)物污染以及氣溶膠污染均可能導致假陽性或者假陰性的結(jié)果。因此，為了保證檢測結(jié)果的準確性，對高通量測序?qū)嶒炇疫M行合理有效的分區(qū)規(guī)劃是至關(guān)重要的。 理想實驗室 分區(qū)原則 實驗室分區(qū)的基本原則是各區(qū)獨立、注意風向、因地制宜、方便工作。 各區(qū)獨立——實驗室各分區(qū)間，不管是空閑時抑或是在使用中，其在物理上都應處于完全分隔狀態(tài)，且各區(qū)域間不能有空氣的直接流通。當需要將試劑物品轉(zhuǎn)移至其他區(qū)時，可通過雙開門傳遞窗傳遞。雙開門傳遞窗以連鎖裝置設計為最佳，即兩邊門不能同時打開。 注意風向——在實驗室各區(qū)間內(nèi)，擴增產(chǎn)物可能會順著空氣氣流進入上游擴增前的相對潔凈區(qū)域。為防止這種污染的發(fā)生，在嚴格分區(qū)的同時，需注意空氣流向?？赏ㄟ^在每個區(qū)域設置正負壓緩沖間，隔絕實驗室內(nèi)外空氣互通。 因地制宜——具體情況具體分析，并不要求實驗室各區(qū)必須相互鄰近，可分散在同樓層的不同處，甚至是不同樓層。 方便工作——日常檢測工作是否方便，除了需要考慮各分區(qū)設計及空間和面積的合理性，大型儀器設備進出是否方便也是分區(qū)設計需要考慮的因素。 除此之外，因各個實驗室檢測項目、檢測平臺、檢測流程以及工作量不同，還需以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”為基本準則，“個性化”設計NGS實驗室分區(qū)數(shù)量和空間大小。 實驗室布局 我們以腫瘤組織基因突變檢測NGS實驗室（illumina平臺，雜交捕獲方法）為例，介紹理想情況下的實驗室布局： 圖1 腫瘤組織基因突變檢測NGS實驗室設計 （illumina平臺，雜交捕獲） 1 試劑準備區(qū) 本區(qū)應為潔凈區(qū)域，用于配制試劑、儲存試劑及消耗品。若其他區(qū)污染通過空氣流入該區(qū)域內(nèi)，將影響后續(xù)操作流程和最終實驗結(jié)果，所以需獨立成區(qū)。此外，該區(qū)還需設置正負壓緩沖間，避免實驗室內(nèi)外空氣流通。后續(xù)各區(qū)域的緩沖間設置原則同該區(qū)一樣。 2 標本制備區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA提取及其定量和濃度檢測。起始DNA模板的質(zhì)量和測序結(jié)果的準確性緊密相關(guān)，需嚴格遵循防污染要求，避免下游擴增產(chǎn)物對其污染。 若樣本為福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，還需設置標本制備前區(qū)，用于標本切片和HE染色。 3 打斷區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA片段化。人類基因組DNA長度過長，而NGS檢測的DNA片段范圍在200~300bp左右，所以在文庫制備前需要進行片段化處理，常用的有超聲打斷的物理方法。 若空間有限，可在標本制備區(qū)專門劃分打斷區(qū)域，但需注意打斷后的樣本不在該區(qū)域開蓋轉(zhuǎn)管，以免污染其他DNA模板，同時做到定期清潔打斷區(qū)。 4 文庫制備區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于構(gòu)建文庫。DNA經(jīng)片段化處理后產(chǎn)生粘性末端，需先修復補平為平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段兩端加上接頭和標簽。若接頭或標簽出現(xiàn)污染，導致樣本間數(shù)據(jù)錯分，檢測結(jié)果的準確性也無法保證。 當標本量較少，且標簽是通過DNA連接酶的非PCR反應加上的，則標本制備區(qū)和文庫制備區(qū)可合并。 5 擴增一區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫的預擴增和純化。文庫擴增涉及PCR過程，產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的氣溶膠，需獨立成區(qū)。 6 雜交捕獲區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于捕獲目的序列。 7 擴增二區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于對捕獲后的文庫進行擴增，同時對終文庫的濃度和片段大小進行檢測以及測序文庫的pooling工作。 8 測序區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫上機測序。房間溫度控制在18~22℃，2小時溫度波動應小于2℃；濕度保持在20%~60%；避免人為引起的震動。 9 電泳區(qū) 本區(qū)為半污染區(qū)，用于檢測提取后的DNA和超聲打斷后的DNA片段分析。 儀器設備 規(guī)劃好各功能區(qū)后，還需配備相應的儀器設備，同時做上明確標記，避免不同區(qū)域間的設備發(fā)生混淆，造成交叉污染。  圖2 各分區(qū)所需基本儀器設備 注：A. 基本儀器配備；B. 樣本制備室專用移液器 量體裁衣 然而，臨床檢測項目繁多，涉及不同的檢測流程以及檢測平臺，那如何將這些項目進行整合，實現(xiàn)實驗室的合理有效布局呢？ 以同時開展病原體檢測、腫瘤基因突變組織學樣本和ctDNA樣本檢測項目的實驗室為例。所使用的檢測平臺包括qPCR、一代測序（Sanger測序）和二代測序（illumina雜交捕獲靶向測序）。 圖3 多檢測項目、多檢測平臺共存情況下的NGS實驗室設計 相比于單檢測項目、單檢測平臺而言，多檢測項目、多檢測平臺共存情況下的NGS實驗室布局要復雜一些，除了要遵循上述分區(qū)原則，還要合理規(guī)劃現(xiàn)有空間，最大限度防止污染發(fā)生，保證日常檢測工作的順利進行。 區(qū)域獨立 1 為避免潛在生物安全風險，單獨設置標本制備三區(qū)，用于病原體DNA的提取。 2 組織與血液提取、文庫制備區(qū) ctDNA濃度低且檢測靈敏度高于組織樣本，為避免樣本間交叉污染，ctDNA樣本和組織樣本需分別設置標本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、擴增區(qū)和雜交捕獲區(qū)來完成DNA提取和文庫制備過程。 區(qū)域共用 在共用區(qū)域操作時，一定要注意防污染，如加樣時，使用帶濾芯的槍頭而非普通吸頭，減少由于吸樣時氣溶膠產(chǎn)生所致的交叉污染；或是樣本經(jīng)瞬時離心后再開蓋；混勻樣本用渦旋振蕩方式或輕彈方式代替吹打方式等。 1 試劑準備區(qū) 本區(qū)為潔凈區(qū)，不涉及樣本核酸，可作為三種檢測項目的共享區(qū)域。 2 擴增四區(qū) 因三種檢測平臺原理不同，故擴增四區(qū)除了用于組織樣本文庫擴增和富集，同時也可作為Sanger測序PCR反應和產(chǎn)物純化以及病原體qPCR檢測分析區(qū)。 3 測序區(qū) 由于二代測序文庫帶有特定的接頭以及Index標簽序列，可與一代測序上機樣本區(qū)分開，二者不會產(chǎn)生交叉污染，因此二代測序上機和一代測序上機可放在同一區(qū)域內(nèi)。 4 電泳區(qū) 電泳區(qū)用于電泳檢測一代測序擴增產(chǎn)物和二代測序判斷核酸質(zhì)量、片段大小分析等步驟的公共區(qū)域。 結(jié)語 綜上所述，NGS實驗室規(guī)范化布局的根本目的是為了提供物理上的阻隔，防止各區(qū)域間的交叉污染。在實際工作中，設計實驗室需要依據(jù)實際情況“量體裁衣”，以保障檢測結(jié)果的準確性。 參考資料： 李金明. 高通量測序技術(shù). 第一版. 北京：科學出版社，2018.  本期介紹的“NGS實驗室布局”就到這里啦，如想了解  |
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來自： 劉得光3p6n6zqq > 《燃石醫(yī)學》
