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植物DNA甲基化研究：

（1）       NAR: 擬南芥AtHDA6與著絲粒周圍DNA甲基化關(guān)系研究

（2）       nature：油棕Karma轉(zhuǎn)座子表觀遺傳重要發(fā)現(xiàn)

關(guān)于玉米DNA甲基化研究，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李青團(tuán)隊和美國明尼蘇達(dá)大學(xué)合作解析了玉米自然群體中的DNA甲基化變異，揭示了DNA甲基化變異的遺傳基礎(chǔ)以及DNA甲基化變異與基因表達(dá)和表型的關(guān)聯(lián)。該成果發(fā)表在開放獲取期刊Genome Biology上。

標(biāo)題：Population-level analysis reveals the widespread occurrence and phenotypic consequence of DNA methylation variation not tagged by genetic variation in maize

期刊：Genome Biol

2021影響因子: IF 13.583

發(fā)表時間：2019.11.19

方法：液相探針捕獲甲基化測序、WGBS測序分析、GWAS分析、RNA-seq

1、研究目的

DNA甲基化是許多植物物種中研究最多的染色質(zhì)修飾。 DNA甲基化在維持基因組完整性方面具有重要作用，也可能影響植物的發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)，特別是在具有復(fù)雜基因組的物種中。 DNA甲基化發(fā)生在植物的CG、CHG和CHH的三個序列環(huán)境中（H=A,C或T堿基），其中CG通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Met1)、CHG通過染色質(zhì)甲基化酶3(CMT3)、CHH通過RNA誘導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)和染色質(zhì)甲基化酶2(CMT2)來維持。

近年來，高通量測序技術(shù)和基因型檢測技術(shù)的發(fā)展極大促進(jìn)了作物遺傳改良，育種家可以根據(jù)大量的SNP數(shù)據(jù)建立模型，預(yù)測表型和進(jìn)行基因組選擇，這一做法的前提是性狀變異由DNA序列變異（SNP）決定。但對于很多性狀，DNA序列變異通常只能解釋部分的遺傳力，仍有相當(dāng)一部分遺傳力無法被解釋，許多學(xué)者將這種現(xiàn)象稱為“消失的遺傳力”，如何尋找并利用這部分遺傳力是遺傳學(xué)家和育種學(xué)家面臨的一個重大挑戰(zhàn)。研究表明，DNA甲基化在玉米不同基因型間存在巨大變異，但無法在群體水平研究DNA甲基化變異的程度及其生物學(xué)功能。

本研究對玉米不同自交系DNA甲基化中自然變異的遺傳基礎(chǔ)和生物學(xué)功能進(jìn)行分析，揭示了存在差異甲基化區(qū)域(DMR)的許多實例證據(jù)，這些區(qū)域包含的信息不能用SNP完全捕獲。并且DNA甲基化的變化與基因表達(dá)變化有關(guān)，這種關(guān)聯(lián)依賴于序列環(huán)境以及DMR距離基因轉(zhuǎn)錄起始位點的位置。此外研究還表明，DNA甲基化變化與玉米的表型變異有關(guān)，可以解釋某些代謝性狀的部分遺傳力。

2、樣本選取

選取263份來自全球熱帶、亞熱帶和溫帶的玉米自交系，在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長至V3，隨后收集第三葉冷凍在液氮中，采用標(biāo)準(zhǔn)的CTAB法（cetyl-trimethyl-ammonium bromide）提取基因組DNA進(jìn)行實驗分析。

3、實驗結(jié)果

①玉米自交系中DNA甲基化變異廣泛存在

作者使用基于探針捕獲的技術(shù)對263份來自熱帶、亞熱帶和溫帶的玉米自交系進(jìn)行DNA甲基化分析，鑒定出大量DNA差異甲基化區(qū)域（Differentially methylated region, DMR），在CG,CHG,CHH上分別鑒定了8864,9759,5705個DMR。將基于捕獲技術(shù)鑒定的DMR與全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）鑒定的DMR進(jìn)行比較，比較結(jié)果相對應(yīng)。DMR沿10條玉米染色體分布，其中許多DMRs位于基因所在區(qū)域，且這些DMRs大小非常相似，在60~1000bp之間，中位數(shù)為200bp。MEF分析（minor epiallele frequency）表明CG和CHG DMR 稀有等位基因表現(xiàn)出低甲基化狀態(tài)，而CHH DMR稀有等位基因通常表現(xiàn)出較高的甲基化水平。

雖然在不同區(qū)域確定了DMRs，但是很多位點發(fā)生了共同變化，并且在CG與CHG上有很大的冗余。作者將CG與CHG上的DMR結(jié)合并鑒定在CG_only、CHG_only和CG_CHG上的DMR，分別有708,944,2223個DMRs。

② DMRs可以區(qū)分玉米亞群

作者使用SNP和DNA甲基化水平計算個體關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示CG DMRs上CG甲基化與不同自交系之間遺傳關(guān)系的關(guān)聯(lián)性顯著高于CHG DMRs上CHG甲基化和CHH DMRs上CHH甲基化，表明CG甲基化可能更穩(wěn)定。使用來自DMR的CG、CHG或CHH甲基化水平進(jìn)行主成分分析（Principle component analysis，PCA），結(jié)果證明了DMRs可以通過不同區(qū)域的甲基化水平將自交系分為不同的亞群，這與基于SNP的分類非常一致，其中CG甲基化區(qū)分亞群的能力最強。CG_only和CHG_only的DMRs與遺傳距離的關(guān)聯(lián)性小于CG_CHG DMR。使用DMR區(qū)分亞群表明存在亞群特異性DMRs。方差分析（an analysis of variance analysis，ANOVA）表明，在一個亞群的大多數(shù)品種中，許多DMRs表現(xiàn)出高甲基化或低甲基化，但沒有發(fā)現(xiàn)一個亞組中只有低甲基化或高甲基化的DMR。

③ 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析來解析DMRs的遺傳基礎(chǔ)

DNA甲基化可能與周圍的遺傳變異有關(guān)，為了研究DMR被SNP標(biāo)記的程度以及不同類型DMR之間是否存在差異，作者使用控制種群結(jié)構(gòu)和個體關(guān)聯(lián)性的混合線性模型（mixed linear model）對約?100萬個高質(zhì)量SNPs進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association analysis，GWAS），共鑒定了4336,4096和1426個CG,CHG和CHH DMR與基因組水平顯著相關(guān)聯(lián)。在這些DMRs中，大多數(shù)僅與一個SNP顯著關(guān)聯(lián)；同樣，大多數(shù)SNP僅與一個DMR相關(guān)。且DMR和相關(guān)SNP之間的距離通常在10Mb以內(nèi)?。因此，如果相關(guān)DMR在10Mb以內(nèi)，則SNP被定義為局部（local）關(guān)聯(lián)SNP；?如果在不同的染色體上，則被定義為遠(yuǎn)端（distal）關(guān)聯(lián)SNP。與玉米基因型在關(guān)聯(lián)panel中的全基因組DNA甲基化沒有明顯變化的觀察結(jié)果一致，未發(fā)現(xiàn)強烈的遠(yuǎn)端熱區(qū)（distal hotspots）。表明在本研究所用的自交系中，主要甲基化機制并未受到影響。

在CG,CHG,CHH三種序列環(huán)境中，CG DMR最有可能通過局部或遠(yuǎn)端與SNP相關(guān)聯(lián)，很少同時與兩類SNP相關(guān)聯(lián)（圖3e）。CHH DMR與SNP相關(guān)聯(lián)最少。重要的是，超過60%的DMRs與SNP沒有明顯的關(guān)聯(lián)性，這可能是因為GWAS分析通過SNP無法捕獲到DMRs中一些特異性信息。在某些情況下，DMRs可能由SNP不能有效標(biāo)記的結(jié)構(gòu)變異引起，這些分析表明，很大一部分DMR不能被SNP或結(jié)構(gòu)變異有效捕獲。

④特異性環(huán)境DMR的染色質(zhì)變異和遺傳控制

對于與SNP顯著相關(guān)聯(lián)的不同序列區(qū)域，DMR的分布存在差異。CG_only（45%）和CHG_only（26%）DMR顯著相關(guān)聯(lián)的SNP DMR比例低于CG_CHG DMR（51%）。表明CG_only和CHG_only DMR不如CG_CHG DMR穩(wěn)定，這與此前研究CG_CHG DMR能更好區(qū)分玉米亞群的結(jié)果一致。在大部分CG_only DMR中，CHG在所有基因型中的水平較低，表明這些區(qū)域不是維持CHG甲基化的Zmet2/Zmet5靶點。大多數(shù)CHG_only DMR在所有基因型中具有高水平的CG甲基化，表明這些區(qū)域是維持CG甲基化酶MET1的靶點。特異性環(huán)境DMR的染色質(zhì)特征也存在差異，CG_only DMR往往具有較低水平的H3K9me2和H3K27me3標(biāo)記，表明CG_only DMR不太可能發(fā)生在具有抑制性染色質(zhì)環(huán)境的區(qū)域中。CHG_only DMR往往具有更高的H3K9me2標(biāo)記。與CG_only和CHG_only DMR相比，CG_CHG DMR具有高水平的H3K9me2和H3K27me3標(biāo)記，且高的H3K9me2標(biāo)記發(fā)生DNA高甲基化DMR中，而高水平的H3K27me3標(biāo)記發(fā)生在DNA低甲基化DMR中，證明了此前研究DNA甲基化和H3K27me3通常表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。

⑤ DMR與基因表達(dá)的自然變異有關(guān)

為研究DNA甲基化和基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，作者以基因表達(dá)作為因變量，以DNA甲基化作為自變量進(jìn)行GWAS分析?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)來自授粉后15天的籽粒，檢測到的基因表達(dá)和甲基化水平之間的顯著關(guān)聯(lián)有1389個，CG,CHG和CHH DMR分別有538,562和289個關(guān)聯(lián)。大多數(shù)顯著相關(guān)的DMR位于與基因相同的染色體上，DMR與基因之間的距離通常小于1?Mb。且大多數(shù)DMR僅與一個基因相關(guān)，這與遠(yuǎn)端熱區(qū)的存在有關(guān)。

CG和CHG DMR與基因表達(dá)主要呈負(fù)相關(guān)，而CHH DMR與基因表達(dá)則主要呈正相關(guān)。DMR越靠近轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS），這種關(guān)聯(lián)性趨勢就越強烈，尤其是在1?kb以內(nèi)的TSS。CG和CHG DMR的負(fù)相關(guān)位于TSS下游，表明在基因組內(nèi)CG和CHG甲基化可能與基因表達(dá)降低有關(guān)。此外，CG_CHG DMR與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性是CG_only和CHG_only的3倍。CG_CHG DMR與CHG_only DMR的CHG甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)CG甲基化隨CHG甲基化而變化時表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，在CG_only DMR中表現(xiàn)正相關(guān)。因此，基因表達(dá)與DNA甲基化之間的關(guān)聯(lián)取決于序列背景（sequence context）。

作者對DMR與不同組織（葉片和籽粒）基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果表明全基因組表達(dá)水平受 DNA 甲基化變異影響，只能通過對許多不同組織或生長條件的分析來證明。且DMR無論是否被SNP標(biāo)記，都可以解釋基因表達(dá)的變化。

⑥ DMRs與基因表達(dá)和表型之間的關(guān)系

差異DNA甲基化可能是差異基因表達(dá)的因或果，作者選擇了與DMR具有強關(guān)聯(lián)性但與基因表達(dá)沒有強相關(guān)的工具SNP，結(jié)果表明基因表達(dá)更可能由DMR引起。接下來，作者利用來自ddm1雙突變核組織的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，結(jié)果進(jìn)一步支持了DNA甲基化可以對基因表達(dá)產(chǎn)生正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的因果影響。

最后作者分析了天然DMR與表型之間的關(guān)系，作者使用了此前進(jìn)行多樣性panel研究中產(chǎn)生的代謝數(shù)據(jù)，以DMR作為自變量，以表型數(shù)據(jù)作為因變量進(jìn)行GWAS分析。在3個獨立的環(huán)境中共鑒定了986個特異性的代謝性狀，其中156個性狀（15.8％）在至少1個環(huán)境中與DMR顯著相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)性狀（76%）與一個DMR有關(guān)。總共發(fā)現(xiàn)43個CG、45個CHG和63個CHH DMR與代謝性狀顯著相關(guān)聯(lián)。有趣的是，與性狀關(guān)聯(lián)的DMR中超過半數(shù)不與SNP關(guān)聯(lián)，且有些性狀只與DMR關(guān)聯(lián)而不與SNP關(guān)聯(lián)，提示DNA甲基化攜帶了特有的遺傳信息。

易基因小結(jié)

本研究對263份來自熱帶、亞熱帶和溫帶的玉米自交系的DNA甲基化進(jìn)行了分析，通過群體分析鑒定出大量DNA甲基化DMR，結(jié)合高密度SNP數(shù)據(jù)、葉片和籽?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)以及籽粒代謝數(shù)據(jù)，解析了DNA甲基化變異的遺傳基礎(chǔ)及其對表型變異的影響。本研究系統(tǒng)解析了DNA甲基化變異的遺傳基礎(chǔ)，并證明DNA甲基化可調(diào)控基因表達(dá)和表型，為解釋消失的遺傳力提供了新的支持。

參考資料：

1、 DOI:10.1038/s41422-020-00465-7

2、 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)官網(wǎng)

原文解讀：

植物DNA甲基化專題 | 玉米：從群體水平揭示DNA甲基化變異對表型的貢獻(xiàn)