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各種組織中上皮細(xì)胞(Endothelial cells, EC) 的異質(zhì)性依然沒有被完全解析。研究構(gòu)建了來自于11個小鼠組織中的超過32000個單上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的圖譜，并識別到78個上皮細(xì)胞亞集，包括健康組織中的==Aqp7+小腸==(腸道)==毛細(xì)血管及健康組織中的生成血管==血管生成==EC細(xì)胞。來自于大腦/精巢==睪丸==，肝臟/脾臟，小腸/大腸以及骨骼肌/心臟的上皮細(xì)胞表達(dá)部分成對的基因==成對表達(dá)部分重疊marker基因==。動脈，靜脈以及淋巴管的上皮細(xì)胞中在更多的組織中共享的標(biāo)志物比異構(gòu)的毛細(xì)血管還要多與異質(zhì)性毛細(xì)血管ECs相比，動脈、靜脈及淋巴管ECs在更多的組織共享更多的marker基因。來自于不同血管床(動脈，毛細(xì)血管，靜脈，淋巴管)的ECs展示出不同組織之間的轉(zhuǎn)錄組相似性，但導(dǎo)致上皮細(xì)胞異質(zhì)性的是組織類型，而不是血管類型。代謝轉(zhuǎn)錄組分析解釋了ECs相似的組織分類的現(xiàn)象以及單獨(dú)的組織中組織之間和血管床之間的ECs以一種組織類型依賴的模式展現(xiàn)出的異質(zhì)性代謝基因的特征。EC圖譜的分類使得在公共scRNA-seq數(shù)據(jù)集中識別EC亞類成為可能，并提供了一種有效的發(fā)現(xiàn)工具以及資源價值。

上皮細(xì)胞組連接了血管，對于氧氣的運(yùn)輸，免疫細(xì)胞運(yùn)輸以及將垃圾廢物送入或者移除組織中來說是非常重要的。然而，單個組織中的ECs在單個細(xì)胞水平上是否存在差異，以及差異的程度如何，以及在特定的血管床中的ECs在不同的組織中是否是異質(zhì)的依然未知。一些單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)的研究已經(jīng)在單個組織中研究過EC的異質(zhì)性。最近，多個小鼠組織的單細(xì)胞圖譜已經(jīng)對ECs進(jìn)行了剖析，但是沒有將關(guān)注EC異質(zhì)性作為主要目標(biāo)。多個組織的一個單細(xì)胞EC轉(zhuǎn)錄組圖譜可以促進(jìn)我們對組織內(nèi)部和組織之間的EC差異性的理解。因此，本研究從11個成年小鼠的組織中提取scRNA進(jìn)行測序。為了增加資源的價值，我們將本研究中用到的數(shù)據(jù)集公開到https://www./software-tools/ec-atlas.

為了高效從多種小鼠的組織中分離出ECs，我們優(yōu)化了EC的分離和純化流程(下圖A)。一共對39182個細(xì)胞進(jìn)行測序，而且每個細(xì)胞平均獲得86766個reads，測序飽和度為93%，每個細(xì)胞平均有1308個基因。==對所有細(xì)胞進(jìn)行降維聚類分群后，根據(jù)marker基因的表達(dá)保留ECs(Pecam1, Cdh5)，同時根據(jù)marker基因剔除污染的SMCs(Acta2), Fibroblast(Col1a1)及紅細(xì)胞(Hba-a1, Hba-a2, Hbb-bs)。最終獲得了來自11個組織的32, 567個ECs(測序飽和度為83%)

來自于不用組織中的EC表現(xiàn)出顯著的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性(下圖B)。

通過基于秩積的方法==(rank product-based method==)來識別每個組織中富集的EC marker基因。發(fā)現(xiàn)前10個標(biāo)記基因的熱圖分析揭示了來自于每個組織中的不同特征，除了比目魚肌和指伸長骨骼肌，表達(dá)出重疊的標(biāo)記基因Top10 marker基因的熱圖分析顯示，除了比目魚肌和趾長伸肌骨骼肌表達(dá)重疊的marker基因外，每個組織具有不同的ECs 簽名集(下圖C)。

值得注意的是，其中的一些top marker基因僅僅在來自于單一一種組織上皮細(xì)胞中表達(dá)(Pglyrp1, Lcn2, and Tmem100分別在大腦，睪丸以及肺中表達(dá))，而其他的EC標(biāo)記基因(Fabp4, Aqp7, Nkx2-3)在一個==兩個==或者多個組織中保守表達(dá)(下圖D)。大部分的標(biāo)記基因都會在來自于特定組織中的==很大一部分==上皮細(xì)胞表達(dá)。來自于一種以上的組織的上皮細(xì)胞的共有標(biāo)記基因的表達(dá)引出了一個問題，這些ECs基因是否在表型上相關(guān)。

為了研究不同組織之間的EC異質(zhì)性，使用層次聚類與多尺度自舉采樣來進(jìn)行相互補(bǔ)充。這個分析揭示了來自于特定組織中的上皮細(xì)胞(精巢和大腦，干仗==肝臟==和脾臟，小腸和結(jié)腸，骨骼肌和比目魚肌以及EDL)在進(jìn)化樹圖==樹狀圖==中聚到了一起，這表明轉(zhuǎn)錄組特征的部分重疊(下圖A)。

為了解釋EC組織分組的現(xiàn)象，我們使用從MSigDB中挑選出來的615個血管相關(guān)的基因集列表來進(jìn)行基因集差異分析==(GSVA==)。排名前10 表達(dá)的基因集的熱圖分析揭示了來自于這些組織中的上皮細(xì)胞高表達(dá)涉及到不同生物過程的基因集(如下圖B，只截取了全圖的部分)。

為了研究驅(qū)動不同上皮細(xì)胞表型的差異性的潛在分子機(jī)制，我們使用了單細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類(sing-cell regulatory network inference and clustering, SCENIC)。該分析預(yù)測，來自于不同組織的ECs上調(diào)表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。例如，F(xiàn)oxq1 和 Hoxd9調(diào)控子分別在大腦和精巢的上皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，而肺上皮細(xì)胞中則富集了Foxf1網(wǎng)絡(luò)，骨骼肌上皮細(xì)胞中Pparg網(wǎng)絡(luò)的活性增加(下圖C)。

本研究通過基于圖像的方法分別對每個組織中的ECs進(jìn)行亞分類，從而對組織內(nèi)部的EC異質(zhì)性進(jìn)行進(jìn)一步探究。我們展示了每個組織特異性的EC類群的前20個或者前50個標(biāo)記基因進(jìn)行，每個組織唯一分子標(biāo)識(unique molecular identifiers，UMIs)以及基因的數(shù)量，以及每個EC亞群的相對比例。每個組織特異性的EC亞群都被提供了一個特異性的注釋(H1代表每個心臟亞群等，如下圖所示)。

為了獲得不同上皮細(xì)胞亞群在血管樹上的位置，我們進(jìn)行了擬時間分析來預(yù)測這些亞類的分化軌跡。該分析預(yù)測了從大動脈到毛細(xì)血管，再到靜脈的分化軌跡。為了將EC亞類的 位置與擬時間分化軌跡進(jìn)行匹配，我們主要關(guān)注的是大腦的ECs，因?yàn)槲覀兪褂昧藙用}，毛細(xì)血管以及靜脈的上皮細(xì)胞，從大腦上皮細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中進(jìn)行識別，或者是基于之前已有的研究來進(jìn)行分析(結(jié)果如下圖B所示，展示的是腦EC表型的假時間軌跡)。

本研究估算了不同血管床的ECs之間的異同(動脈，毛細(xì)血管，靜脈，淋巴管)，這些血管床由大量的ECs，而且分布在不同的組織中(如下圖A所示)。

對于每個組織，我們將所有的類群匯集為以下一些EC表型：(1)動脈ECs(包括大動脈和動脈的EC亞型);(2)毛細(xì)血管EC(所有的毛細(xì)血管EC亞型);(3)靜脈EC(大靜脈和靜脈EC亞型)，以及(4)淋巴ECs(所有的淋巴EC亞型)。兩個血管床的ECs表達(dá)的基因(毛細(xì)血管-動脈以及毛細(xì)血管-靜脈ECs)，以及僅僅局限在一些組織中的ECs，被排除在外(如下圖B所示)。

在>=80%的組織中，median rank<35的標(biāo)記基因被認(rèn)為是保守的血管床標(biāo)記。當(dāng)使用在25%的組織(對應(yīng)1或2個組織)中發(fā)現(xiàn)的median rank 小于20的組織特異性血管床標(biāo)記物進(jìn)行分析時，我們發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管的炎癥特異性標(biāo)記物多于淋巴管。(如下圖D所示)

在探究來自于不同組織中的血管床(動脈，毛細(xì)血管，靜脈，淋巴管)中轉(zhuǎn)錄組水平上的相似性時，發(fā)現(xiàn)動脈ECs的轉(zhuǎn)錄組特征在不同的組織之間是十分相似的，但是不同于毛細(xì)血管，靜脈或者淋巴管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。類似的發(fā)現(xiàn)也在毛細(xì)血管，靜脈以及淋巴管ECs中發(fā)現(xiàn)(如下圖E所示)。

在腸道中鑒定到了一部分(5.6%，23.2%)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中涉及甘油和脂肪酸的攝取和代謝的基因轉(zhuǎn)錄水平升高(Aqp7, Tcf15, Cd36, Fabp5)(如下圖A所示)。

在大腦中識別到一小簇脈絡(luò)叢毛細(xì)血管上皮細(xì)胞，其特征為高表達(dá)標(biāo)記基因Plvap。

通過對代謝相關(guān)基因的分析，由層次聚類和多尺度自助重采樣補(bǔ)充分析方法得到的分析結(jié)果與ECs的組織分組結(jié)果類似，這與使用代謝基因(第一張圖A)與非代謝基因(下面第二張圖A)的得到的結(jié)果一致，表明代謝轉(zhuǎn)錄組特征對ECs的表型分組貢獻(xiàn)最大。

該研究識別到了重要的標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因在來自于大腦，精巢以及肺的ECs中大量富集。來自于其他組織中(心臟，比目魚肌，結(jié)腸，肝臟，脾臟，腎臟以及趾長伸肌)的ECs至少共享兩個或者更多的重要標(biāo)記基因。

基于部分重疊轉(zhuǎn)錄組特征和共同推斷的生物學(xué)特征，該提出了一種新的功能或解剖學(xué)相關(guān)組織(腦/睪丸、肝/脾臟、小腸/結(jié)腸和骨骼肌/心臟)的內(nèi)皮細(xì)胞分類。

在所有被分析的組織中，來自每個血管床(動脈、毛細(xì)血管、靜脈、淋巴)的內(nèi)皮細(xì)胞在Jaccard相似性分析中聚集在一起，這意味著，在整個組織中，來自每個血管床的內(nèi)皮細(xì)胞比來自另一個血管床的內(nèi)皮細(xì)胞更相似。

研究鑒定出了高度特化的EC表型，如腸Madcam1+靜脈ECs和Aqp7+毛細(xì)血管ECs以及腦脈絡(luò)膜叢ECs。

作為scRNA-seq分析的另一個表型解讀，本研究探索了來自不同組織中不同血管床的ECs是否以及在何種程度上也表現(xiàn)出其代謝轉(zhuǎn)錄組特征的異質(zhì)性。

該研究EC Atlas taxon- omy在小鼠組織公開的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中注釋EC的有效性，這不僅為不同組織中不同EC表型的分子特征提供了豐富的資源，而且也為其他數(shù)據(jù)集中表型未知的EC的識別提供了一個可靠的參考技術(shù)。

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