體外α-Syn的LLPS

       為了預(yù)測α-Syn的LLPS，作者分別用SMART和IUPred2運算法則去檢測低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域（LCDs）和本質(zhì)無序區(qū)域的存在。SMART分析預(yù)測了兩個LCDs（殘基10-23和63-78，圖1a)和IUPred2揭示在α-Syn序列中有三個片段（殘基26-28、54-56和99-140，圖1a）。在諸如 10% 聚乙二醇 (PEG)-8000 之類的分子聚集體存在下，α-Syn 顯示在體外濃度≥200μM 時形成液體狀液滴（圖1b）。使用異硫氰酸熒光素 (FITC) 標記的 α-Syn（10% 標記）蛋白通過光散射和熒光成像進一步證實了液滴的形成（圖1c）。值得注意的是，10% 標記蛋白質(zhì)的存在并未改變 α-Syn 的主要生物物理特性。此外，增加分子擁擠會降低用于相分離的蛋白質(zhì)的臨界濃度（圖 1d），這表明分子擁擠引起的局部濃度增加足以啟動α-Syn 的LLPS。

       為了開發(fā)相體系，作者比較了不同濃度和不同pH值（pH5.4和7.4，在沒有和存在10%PEG的情況下）下α-Syn的相分離。在低pH（5.4）時，α-Syn在沒有和存在PEG的情況下，即使在10μM和5μM濃度下也會形成液滴（圖1e）。因為蛋白質(zhì)的相分離與溫度有關(guān)，作者用200um的蛋白濃度研究了4°、18°、25°和37°C的條件下α-Syn的LLPS發(fā)現(xiàn)48h后α-Syn在所有溫度（4°C除外）下形成液滴。為了檢查與溫度相關(guān)的可逆性，α-Syn液滴(d2)接受了高溫(65°C)的測試。這些液滴最初在1小時后消失，但在37°C冷卻后在3小時內(nèi)重新出現(xiàn)，這表明它們具有可逆的和類似液體的性質(zhì)。相比之下，老化的（d20）液滴對高溫（65°C）不敏感。當加熱到65°C持續(xù)6h時，只有液滴的尺寸減小，而隨后在37°C孵化持續(xù)24h時液滴的尺寸完全恢復(fù)(圖1f)。這表明α-Syn液滴隨著時間呈液體到固體的轉(zhuǎn)變，類似于其他蛋白質(zhì)，包括FUS、TDP-43和tau。

圖1 α-Syn在體外經(jīng)歷LLPS

       接下來作者研究了液滴中α-Syn分子在其形成和成熟過程中的動力學(xué)特性。作者觀察到由于 Ostwald 成熟和液滴融合，液滴的大小隨著時間推移而增大（圖2a）。例如，作者發(fā)現(xiàn)兩個液滴合并形成一個更大的液滴（圖2b），這表示液滴的融合。此外，較小液滴的逐漸消失及同時附近較大液滴的生長表明Ostwald成熟的可能性。為了表征液滴內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學(xué)，作者在光漂白實驗后使用rhodamine標記的 α-Syn(rhod-α-Syn)(10% labelled) 形成的液滴進行熒光恢復(fù)（FRAP）。與FITC類似，10% rhodamine標記蛋白的存在并不會改變α-Syn的任何生物物理特性。液滴形成（d2）后，F(xiàn)RAP研究發(fā)現(xiàn)了一個快速（半衰期（t1/2）為3.75s）且完全的熒光恢復(fù)（~96%）。然而，隨著時間的推移，動力學(xué)和恢復(fù)率大幅下降(在d20時的恢復(fù)率為7.5%)（圖2c-e）。從t1/2中作者估計d2、d5和d10的蛋白質(zhì)分子的表面擴散系數(shù)(Dapp)分別為0.584、0.23和0.18um²s^–1（圖2f）。FRAP恢復(fù)的減少（隨著老化）表明了材料性質(zhì)（如剛性）的變化，這可能是由于液滴內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集。在液滴成熟過程中內(nèi)部α-Syn的分子擴散減少可能歸因于液滴粘彈性的變化。盡管 FRAP 測量提供了有關(guān) α-Syn 在液滴中的平移動力學(xué)的信息，作者進行了基于顯微鏡的時間分辨熒光各向異性衰減，以揭示 α-Syn局部和全局水平的旋轉(zhuǎn)動力學(xué)。在不同的時間間隔測量了內(nèi)部(P1)和外部(P2)FITC標記的α-Syn液滴的各向異性衰減（圖2g），數(shù)據(jù)清楚顯示，與外部相比(?=1.0ns)，液滴內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子旋轉(zhuǎn)運動減少，因此剛性更大（在d2的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間（?）=1.6ns）（圖2h）。然而，與從液滴外部獲得的衰減模式不同，從它們內(nèi)部獲得的各向異性衰減顯示出漸近點的y截距。這反映了由于分子的較高剛性而存在的很長的相關(guān)時間(C)的振幅。此外，在d10時液滴內(nèi)的α-Syn分子比剛形成的d2液滴(?=1.6ns)更具剛性(?=1.8ns)。這些觀察結(jié)果連同F(xiàn)RAP恢復(fù)數(shù)據(jù)，清楚地指出了α-Syn在老化時的從液體到固態(tài)的轉(zhuǎn)變。

圖2 LLPS中α-Syn的動力學(xué)會隨著時間的推移而減慢

      為了建立α-Syn聚集（寡聚體和原纖維的形成）和LLPS之間的直接相關(guān)性，作者同時使用ThT熒光和各種顯微技術(shù)監(jiān)測聚合動力學(xué)。此外在LLPS和聚集過程中作者分離并量化了隨時間形成的不同α-Syn種類的相對數(shù)量（來自同一樣本）（圖4a）。以前也用過類似的方法來分離α-Syn的寡聚中間體。利用TEM的圓二色性和形態(tài)對分離種類的二級結(jié)構(gòu)進行了表征。聚合動力學(xué)和LLPS結(jié)果表明，液滴是在聚集的早期滯后階段形成的（圖4b,c）。對不同種類的定量表明，在LLPS的早期(d5)約90%為低分子質(zhì)量的α-Syn（主要是單體)、少量寡聚物(約8%)和原纖維 (約2%）（圖4b）。然而，在液滴成熟過程中觀察到低分子質(zhì)量種群的顯著減少和原纖維的增加，寡聚物的數(shù)量從d10到d30保持不變，這表明寡聚體中間體可能已達到穩(wěn)態(tài)（圖4b）。TEM和圓二色性數(shù)據(jù)表明，低分子質(zhì)量分數(shù)大多是非晶形的，具有隨機線圈結(jié)構(gòu)。寡聚體部分主要顯示出具有螺旋結(jié)構(gòu)的球狀形態(tài)(d5和d10除外)。纖維部分主要含有具有β片段結(jié)構(gòu)的淀粉樣。盡管四聚體和膜結(jié)合單體 α-Syn 富含螺旋結(jié)構(gòu)是已知的，但在 α-Syn 聚集過程中，寡聚體α-Syn富含螺旋結(jié)構(gòu)也很明顯。總的來說，數(shù)據(jù)指出了各種α-Syn種類（單體、寡聚物和纖維）之間的動態(tài)相互作用，在LLPS過程中，單體通過寡聚物介導(dǎo)的過程逐漸轉(zhuǎn)化為纖維聚物。

       此外，作者還在整個LLPS和聚合過程（d30）中，用顯微鏡在不同的時間間隔檢查了液滴。野生型α-Syn(ThioS)染色在相分離開始的背景中顯示擴散熒光信號，然而在后期(d5以后)，Thios很容易共分割成液滴，這表明了淀粉樣聚物的存在。TEM成像進一步證實了這一點，顯示了d30的纖維聚集體(圖4c)。有趣的是，在d20之后，作者觀察到蛋白質(zhì)聚集物從液滴的子集中出現(xiàn)（圖4d），當使用高分辨率TEM成像時，在單個液滴內(nèi)觀察到纖維狀結(jié)構(gòu)（圖4e）。在d30后，LLPS溶液經(jīng)凝膠反轉(zhuǎn)試驗和掃描電子顯微鏡(SEM)確認，轉(zhuǎn)化成了水凝膠（圖4f)。用α-Syn水凝膠進行頻率掃描體積流變測量顯示超過損失模量（表面粘度G）的更高的存儲模量（表面彈性G），表明凝膠和/或類似固體的行為（圖4g)。

       接下來，作者驗證這兩種家族性突變A53T和E46K是如何調(diào)節(jié)α-Syn的液固轉(zhuǎn)變和凝膠形成。除了數(shù)量增加、形成更大體積的液滴和更高的光散射外，兩個突變體都顯示出了更快的聚集。此外，與野生型α-Syn相比，ThioS早期分割A(yù)53T和E46K液滴(在d2)，這表明A53T和E46K在液滴內(nèi)能更快地聚集到淀粉樣原纖維中。與野生型蛋白相比，這兩種突變體也表現(xiàn)出更硬的水凝膠形成。

圖4 α-Syn 相分離液滴成熟并老化成纖維狀聚集體

       為了確定殘基特異性水平上LLPS的域相互作用，作者記錄了二維[15N-1H]單核單量子相干(HSQC)譜。作者選擇了野生型α-Syn和兩個家族性突變體(A53T和E46K)來比較結(jié)構(gòu)域相互作用的程度。直接維數(shù)(HN)中的窄信號色散表明了蛋白質(zhì)的無序狀態(tài)。在LLPS過程中，野生型α-Syn顯示在N端（V3-A27、V37-K43和H50-E57)和NAC區(qū)域（V74-V82和A89-K97）處的殘基強度逐漸下降，C端（I112-N122）的殘基強度降得更低（圖5a,b）。突變體A53T和E46K也有類似的觀測結(jié)果但有一個N端和NAC區(qū)域的核磁共振信號的快速降低。對于E46K，在d3后，大部分殘基的酰胺交叉峰消失而出現(xiàn)新的峰，這表明構(gòu)象的重大變化。在d20時，核磁共振信號的廣泛展寬和移動表明，這三種蛋白都形成了高階結(jié)構(gòu)。因此，核磁共振數(shù)據(jù)表明除了無序的N端外，疏水的NAC區(qū)域也可能與α-Syn LLPS有關(guān)。用α-Syn位點特異性的單Trp突變體(N端，3W；NAC區(qū)域，71W；C端，124W)的時間分辨熒光衰變測量進一步支持了這一推論。以前研究表明在這些位置引入Trp并沒有改變α-Syn的性質(zhì)。時間分辨熒光強度衰減分析表明，由于LLPS，Trp探針的局部環(huán)境沒有實質(zhì)性變化（圖5c,d）。然而，從更快的相關(guān)時間（?1)及其振幅(α1）可以明顯看出在LLPS之后N端和NAC區(qū)域的結(jié)構(gòu)剛度比C端要高得多(圖5e,f)。 為了檢查 N 端和 NAC 區(qū)域的結(jié)構(gòu)剛性是否是由于相分離后的分子間相互作用，作者進行了 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)實驗。使用標記有 DTNB 的 α-Syn 的單個半胱氨酸 (Cys) 突變體作為受體，而互補的 Trp 突變體作為供體。與 N 端和 NAC 區(qū)域相比，LLPS 早期 C 端的能量轉(zhuǎn)移效率較低（圖 5g）。這表明 N 端和 NAC 區(qū)域的域間相互作用可能會驅(qū)動α-Syn液滴的形成。

       為了進一步確定這些結(jié)構(gòu)域參與液滴成熟為類固體相的過程，作者以單液滴分辨率對α-Syn NAC結(jié)構(gòu)域進行了FRET顯微觀察。選擇了位于第74位的熒光素-5-馬來酰亞胺標記的α-Syn作為供體以及位于同一位置的rhodamine-c2-馬來酰亞胺標記的α-Syn作為受體。利用這些方法，制備了三個相分離的樣品，只包括供體（熒光素-α-Syn）、只有受體（rhodamine-α-Syn）和等摩爾比的供體受體。包含供體和受體的單個液滴的能量映射和空間分辨熒光成像顯示，當選擇性激發(fā)供體熒光團時，受體熒光團的致敏發(fā)射增強(圖5h)。這是供體分子間蛋白的特征，因為接近相當一部分供體和受體標記的蛋白。此外，在每一個液滴中，敏化發(fā)射（或明顯的FRET效率）的增強程度（由于能量轉(zhuǎn)移引起的強度增強因子，IEFET）隨著孵化時間的推移而逐漸增加（圖5i），這表明每個液滴中的α-Syn分子越來越接近。α-Syn NAC域在LLPS中的重要性進一步明顯，因為β-突觸核蛋白在NAC域中缺乏8個疏水氨基酸延伸，既沒有顯示聚集，在實驗條件下也沒有顯示LLPS。有趣的是，在LLPS相關(guān)的條件下，另一個人類突觸核蛋白γ-突觸核蛋白也沒有顯示任何相分離和/或聚合，即使在延長孵化。γ-突觸核蛋白聚集非常緩慢，這可能是由于C端沒有兩個Tyr殘基，以及NAC結(jié)構(gòu)域的三種甘氨酸被具有高電荷的谷氨酸殘基取代。相比之下，與野生型α-Syn相比，α-Syn核心（30-110個殘基）表現(xiàn)出更快的聚合和LLPS，這進一步證明了核心/NAC域?qū)LPS的重要性。

圖5 LLPS 期間 α-Syn 的位點特異性構(gòu)象變化和動力學(xué)

      為了證明細胞中的α-Syn LLPS，作者培養(yǎng)了HeLa細胞，過度表達四半胱氨酸標記的α-Syn(C4-α-Syn)24和48小時，隨后用FlasH-EDT2染色C4-α-Syn。只有約20%的細胞顯示細胞質(zhì)蛋白積累，而其余細胞顯示C4-α-Syn的擴散泛細胞定位(圖6a)?；阼F與α-Syn之間可能存在的病理聯(lián)系，作者研究了鐵對細胞中α-Syn LLPS的影響。引人注目的是，在用10mM檸檬酸鐵銨處理24小時后，>95%的細胞顯示出細胞質(zhì)液滴樣集合（每個細胞285±116液滴）(圖6a)，平均直徑0.46μm(圖6b）。48小時后，這些液滴主要聚集并定位在核外區(qū)域。然而，液滴的數(shù)量在48小時后后顯著減少（每個細胞76±21個液滴），其平均直徑增加到0.61μm(圖6b)。這24 小時液滴是高度移動的并經(jīng)歷了頻繁的融合事件，迅速弛豫成球形組件（圖6c）表示它們的液體樣狀態(tài)。這些液滴沒有顯示任何與尼羅河紅色（脂滴染色）和膜結(jié)合細胞器（溶酶體和線粒體）標記物的共聚，這表明它們的無膜質(zhì)狀態(tài)。

       為了檢查C4-α-Syn分子的動態(tài)特性，作者進行了細胞內(nèi)的FRAP。作為對照組，選擇了具有擴散表達的區(qū)域來確定FlAsH染色的C4-α-Syn的細胞內(nèi)動力學(xué)。作者發(fā)現(xiàn)無液滴區(qū)域的部分恢復(fù)(t1/2=10±3.04恢復(fù)約56%)，這表明C4-α-Syn在細胞環(huán)境中擴散緩慢。24小時處理后，與48小時相比，液滴內(nèi)的熒光恢復(fù)速度更快，表明α-Syn分子在24小時時可以在細胞質(zhì)池擴散和平衡，這與類液體的狀態(tài)性質(zhì)一致（圖6d）。48小時的動力學(xué)減少可以歸因于液固轉(zhuǎn)變，可能是由于C4-α-Syn在這些液滴中的聚集。當細胞用另一種金屬離子Cu2+處理時，也觀察到類似的液滴形成和液固轉(zhuǎn)變。然而，與鐵誘導(dǎo)液滴（48 小時）相比，銅誘導(dǎo)液滴的成熟更快（36 小時），這與體外 FRAP 和各向異性研究一致（圖 3）。

       隨后，作者在細胞內(nèi)進行了單粒子跟蹤測量以研究單個α-Syn液滴在24小時和48小時后的擴散動力學(xué)。24小時后的分析顯示液滴具有主要的超擴散行為（指數(shù)α>1），這表明液滴主動或促進的運動，可能是由細胞機器輔助的(圖6e)。計算出的粒子軌跡的平直度也與其α值呈正相關(guān)，這進一步支持了這些類液體液滴的定向運動。然而，在48小時后，大多數(shù)液滴的α分布轉(zhuǎn)移到較低值（α≤1）(圖6e），表示一種（子）擴散行為，可能由液滴大小及其微環(huán)境控制。

        為了探討α-Syn液滴的超擴散位移的機制和微管的可能參與，用微管解聚合劑nocodazole對細胞進行了處理。在微管不穩(wěn)定時，大多數(shù)液滴在24小時內(nèi)聚集在一起（圖6f）。微管去穩(wěn)定后α分布顯示了值≤1的相當大的變化，這表明自由和/或亞擴散運動(圖6e）。這支持了微管網(wǎng)絡(luò)參與液滴的運動，表明類液體的α-Syn液滴的遷移最初在微管的幫助下更有方向，但在液固轉(zhuǎn)變及其對核外區(qū)域的定位后大大減少。

圖6 細胞中 α-Syn 的液體狀凝聚物

       隨時間推移α-Syn液滴變成了更剛性的組件，作者驗證LLPS是否會在細胞中觸發(fā)α-Syn淀粉樣蛋白聚集。使用淀粉樣特異性O(shè)C抗體與α-Syn在不同時間的免疫共沉淀來檢測纖維的形成。點跡分析顯示，隨時間推移，處理和未處理細胞的OC信號都在增加（圖6g）。然而，與未處理的細胞相比，處理48小時后的細胞OC免疫反應(yīng)活性顯著增加。引人注目的是，細胞活力仍然沒有受到影響，這可能是由于核周聚集體的形成。事實上，由于 Fe3+ 或 Cu2+ 處理在 HeLa 細胞中形成了聚集體，這通過α-Syn 與 ProteoStat（一種聚集體標記）和相應(yīng)的 聚集體傾向因子的共定位得到證實（圖6h）。總的來說數(shù)據(jù)表明金屬誘導(dǎo)的LLPS觸發(fā)細胞的聚集體形成，這是由微管調(diào)節(jié)的。

圖7 α-Syn LLPS和聚合的潛在機制示意圖

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