在最新發(fā)布的全球高疾病負(fù)擔(dān)排行榜上看出，呼吸道感染仍然位于全球死因的前列（如圖1）。引起呼吸道感染的病原具有種類多、變異頻、含量低的特點(diǎn)，往往還存在復(fù)雜的共感染[1]，使得呼吸道感染的病原檢測(cè)診斷難度較大。因此，呼吸系感染性疾病的病原學(xué)診斷一直是呼吸系感染性疾病領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。

圖1：全球高疾病負(fù)擔(dān)排行榜

（一）病原學(xué)診斷的挑戰(zhàn)

在呼吸道病原學(xué)診斷上的挑戰(zhàn)主要來自四個(gè)方面：（1）病原種類多，但傳統(tǒng)認(rèn)知的感染病原種類有限，檢測(cè)范圍受限；（2）呼吸道作為開放的腔道，復(fù)雜人體共生微生物的存在會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果；（3）新發(fā)或罕見人類感染病原的鑒別受到檢測(cè)技術(shù)影響；（4）自然界潛在可感染人類的微生物識(shí)別尚不完全。

前沿技術(shù)的發(fā)展極大促進(jìn)了對(duì)新發(fā)病原的認(rèn)識(shí)，如「新冠病毒」等的發(fā)現(xiàn)和鑒定，提高了對(duì)病原譜組成的認(rèn)知范圍；人體微生物組研究領(lǐng)域的發(fā)展，豐富了對(duì)感染病原的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)的特定呼吸道微生物組組成與呼吸道感染的關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生了可完善教科書的知識(shí)；但在病原學(xué)診斷中，復(fù)雜的人體共生微生物成為不可忽視的干擾因素。目前人類對(duì)于病原體的認(rèn)知還比較有限，據(jù)估計(jì)全球有約100萬種病毒，但已發(fā)現(xiàn)可感染人類的病毒僅有200多種[2]（如圖2），自然界中尚有大量的潛在感染人類的病原有待認(rèn)識(shí)，這成為病原學(xué)診斷面臨的巨大挑戰(zhàn)。

圖2

（二）病原病因?qū)W診斷能力提升感染性疾病診療能力

呼吸道是與外界直接相通的器官，每天吸入的空氣中含有大量的微生物，部分可能成為感染病原。針對(duì)多種病原，能否第一時(shí)間確定其種類，完成病因?qū)W診斷，這是提升我們的感染性疾病診療能力的關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)外的呼吸道感染病原學(xué)研究表明，即使用靈敏的分子生物學(xué)方法篩查病原，也有近50%的病例無法找到明確病原學(xué)證據(jù)[3~7]（圖3）。針對(duì)不明原因感染，尤其是新發(fā)突發(fā)的呼吸道傳染病疫情，能否第一時(shí)間鑒定到病原，對(duì)國(guó)家和社會(huì)安全則是具有至關(guān)重要的意義。

圖3

（三）檢測(cè)技術(shù)驅(qū)動(dòng)病原學(xué)診斷的發(fā)展

病原學(xué)診斷的發(fā)展由檢測(cè)技術(shù)來驅(qū)動(dòng)的。回顧病原學(xué)診斷歷史，從革蘭氏染色和培養(yǎng)，到確證病原的科赫氏定律，發(fā)展到現(xiàn)代的PCR方法、Sanger測(cè)序法和下一代測(cè)序方法等，技術(shù)的進(jìn)步使得感染病原學(xué)領(lǐng)域研究快速積累了大量的數(shù)據(jù)，促進(jìn)了對(duì)感染病因?qū)W的認(rèn)識(shí)。但是，在臨床實(shí)踐中，檢測(cè)病原的收益等仍處于不斷討論和形成共識(shí)的過程中。

（四）病毒檢測(cè)的臨床收益

2021年美國(guó)胸科協(xié)會(huì)評(píng)估了疑似社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia，簡(jiǎn)稱CAP）的患者開展流感病毒以外的其他病毒的檢測(cè)的臨床收益[8]。認(rèn)為門診病例可做流感病毒檢測(cè)，但對(duì)于流感以外的病毒，考慮到臨床診療的收益不大，不建議進(jìn)行常規(guī)的篩查。對(duì)于住院病例，推薦常規(guī)篩查流感病毒，不推薦常規(guī)檢測(cè)流感病毒以外的病毒。對(duì)于重癥CAP和免疫功能低下的人員推薦篩查是否存在其他的病毒以及支原體和衣原體等非典型病原體。上述不推薦常規(guī)篩查流感病毒以外的其他病毒，是由于循證的依據(jù)不足。因?yàn)槭欠駲z測(cè)流感病毒以外的病毒，對(duì)于是否縮短抗生素使用時(shí)長(zhǎng)和住院時(shí)長(zhǎng)，并無明確的臨床收益。我國(guó)學(xué)者基于多中心的臨床病原學(xué)研究認(rèn)為非流感病毒在導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重程度和臨床轉(zhuǎn)歸上與流感病毒具有同樣重要的作用[9]。觀點(diǎn)存在爭(zhēng)議的原因是由于該類研究設(shè)計(jì)還十分有限，進(jìn)一步需要完善研究設(shè)計(jì)，更關(guān)注臨床收益，通過數(shù)據(jù)積累增加證據(jù)強(qiáng)度。

雖然檢測(cè)非流感病毒對(duì)門診和住院的普通肺炎病例臨床收益不顯著，但在重癥CAP患者，由于可能存在多種病原的共感染，也可能是流感病毒以外的其他病毒導(dǎo)致的重癥感染，因此，對(duì)重癥CAP患者增加流感病毒以外的其他病毒檢測(cè)在抗病毒藥物的使用方面，仍具有很好的數(shù)據(jù)參考價(jià)值。

明確病原譜，提供循證依據(jù)，才能促進(jìn)呼吸道感染的精準(zhǔn)診斷。因此，感染的病原病因?qū)W診斷是臨床診斷的重要參考依據(jù)已經(jīng)是共識(shí)；但對(duì)流感病毒以外的其他病毒的檢測(cè)的收益方面，仍需要更多的呼吸道感染病原學(xué)研究數(shù)據(jù)的支撐。

作者所在的課題組在呼吸道感染病毒病原學(xué)方面開展多年的研究，目的是為改變臨床實(shí)踐提供數(shù)據(jù)參考。我們提出的問題一是門診急性呼吸道感染和成人CAP患者，除了檢測(cè)流感病毒，其他病毒有無增加的必要？二是對(duì)于輕癥的成人CAP患者，是否有必要檢測(cè)多病原，檢測(cè)頻次如何？三是對(duì)呼吸道局部微生物組特征的認(rèn)識(shí)和分析，能否作為呼吸道感染潛在的新型的生物標(biāo)識(shí)？

（一）研究設(shè)計(jì)

急性呼吸道感染病例病毒組成特征是什么？通過與全國(guó)的同行合作，基于統(tǒng)一的病例入組標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一的操作規(guī)程和檢測(cè)方法，開展樣本的采集和病原檢測(cè)（如圖4）。

圖4

門診患者常見的呼吸道病毒感染種類包括流感病毒（IFVs A/B/C）、副流感病毒（HPIVs1/2/3/4）、呼吸道合胞病毒（RSV-A/B）、人冠狀病毒（HCoVs），人偏肺病毒（hMPV）、博卡病毒（HBoV）、腺病毒（HAdVs）和鼻病毒（HRVs）。

我們把能夠感染人類呼吸道的病毒分屬于7個(gè)科，28種屬。在迄今入組的1萬余呼吸道感染數(shù)據(jù)中，能夠檢測(cè)到上述所有科屬病毒的流行。

（二）門診急性呼吸道感染病毒檢出情況

在門診病例中，共有61%病例多病原檢測(cè)結(jié)果為陰性（如圖5）。在所有檢出的病毒中，IFVA/B占據(jù)了67%[9]，這組數(shù)據(jù)支持前文提到的對(duì)門診病例首要推薦檢測(cè)IFVs。如果同時(shí)檢測(cè)IFVs和EVs，或IFVs EVs RSV，則占陽(yáng)性檢出的92%[10]。上述研究發(fā)現(xiàn)提示，在門診病例病原學(xué)診斷中，是否通過分類檢測(cè)的方式，在可控的收費(fèi)情況下，更大程度的獲取陽(yáng)性檢出結(jié)果，是否可增加病人收益，還需要進(jìn)行更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯吭O(shè)計(jì)來給出科學(xué)依據(jù)。

圖5

（三）門診和住院呼吸道感染病例病原譜差異顯著

分析兒童的呼吸道感染病原學(xué)數(shù)據(jù)（如圖6），我們發(fā)現(xiàn)兒童呼吸道感染門診和住院患者病原的分布差異顯著，RSV在住院的病例中檢出率較高，而IFVs在門診病例中檢出率更高。經(jīng)過歸因分析，HAdvs和RSV單獨(dú)感染、IFVs RSV共感染是患兒住院的危險(xiǎn)因素。

圖6

（四）國(guó)外成人CAP常見呼吸道感染病原的檢出

2021年的《自然綜述- Disease Primers》雜志發(fā)表的一篇綜述指出成人CAP患者中IFVs、HRVs和肺炎鏈球菌檢出率最高[11]（如圖7）。

圖7

2015年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報(bào)道了美國(guó)CAP病例病原學(xué)數(shù)據(jù)（如圖8），顯示病原檢出率最高的是HRVs，其次是IFVs，病毒的檢出率高于細(xì)菌[12]。我們的數(shù)據(jù)則顯示，國(guó)內(nèi)呼吸道感染多病原中細(xì)菌檢出率高于病毒，可見不同國(guó)家呼吸道感染的病原譜的差異比較大。提示在本土病原學(xué)研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)性地建立呼吸道感染病原檢測(cè)策略。

圖8

（五）小結(jié)

1、呼吸道感染病例門診和住院病原譜組成特征提示可開展病原學(xué)的分級(jí)診斷；

2、門診病例，是否可建立基于年齡的病原分級(jí)檢測(cè)；

3、我國(guó)成人CAP病原譜與歐美國(guó)家存在差異，提示需優(yōu)化診療指南。

隨著人體微生物組功能研究的不斷深入，對(duì)于呼吸道感染的概念也從單一病原感染變成共生菌穩(wěn)態(tài)失調(diào)?；诤粑牢⑸锝M去發(fā)展新的生物標(biāo)識(shí)物，已經(jīng)成為全球的發(fā)展熱點(diǎn)。現(xiàn)有研究表明，呼吸道微生物組和慢性阻塞性肺疾病、哮喘、囊性纖維化、肺炎、肺癌等不同類型疾病的進(jìn)展都有密切關(guān)聯(lián)。

（一）呼吸道微生物組的生物標(biāo)識(shí)作用

人體微生物組能否作為感染的生物標(biāo)識(shí)，其在感染病因?qū)W上的貢獻(xiàn)度有多大？目前尚無明確的答案。課題組基于新冠病毒感染者開展了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)新冠肺炎病例與非新冠病毒感染的CAP及健康組比較，微生物組組成有顯著差異[13]（如圖9）。這提示感染微生物組組成與疾病之間可能具有規(guī)律性的關(guān)聯(lián)。

圖9

（二）突破性分子診斷技術(shù)：宏基因組學(xué)

基于人體微生物組的感染新理念的提出，依賴于新技術(shù)的發(fā)展，特別是宏基因組檢測(cè)技術(shù)發(fā)揮了不可或缺的重要作用，以下交流這一技術(shù)的應(yīng)用和優(yōu)化方向。宏基因組學(xué)（Metagenomics Next Generation Sequencing, mNGS），是對(duì)DNA/RNA高通量測(cè)序的方法，用于病原學(xué)檢測(cè)，可一次完成對(duì)樣本中的細(xì)菌，真菌，病毒和寄生蟲等自然界已知微生物的檢測(cè)。

目前，利用宏基因組學(xué)技術(shù)解析感染病例的病原組成，技術(shù)上已經(jīng)建立了基本的操作流程，這一方法也廣泛用于病原檢測(cè)監(jiān)測(cè)、未知病原檢測(cè)鑒定、疾病微生物組學(xué)分析。但這一方法還存在很多待優(yōu)化的內(nèi)容。

1、宏基因組測(cè)序在病原分析中的優(yōu)化要求：

①降低人源宿主干擾，富集病原體；

2、宏基因組測(cè)序在病原學(xué)診斷中的提升指標(biāo)：

①更加革新，適應(yīng)臨床檢測(cè)「剛需」，協(xié)同其他技術(shù)體系，傳統(tǒng)培養(yǎng) 藥敏：耐藥基因 病原體 菌株毒力；

3、技術(shù)方法應(yīng)用的適宜性

宏基因組學(xué)技術(shù)的使用，其「門檻」高于常規(guī)PCR分子方法。近兩年國(guó)內(nèi)外發(fā)表了多項(xiàng)專家共識(shí)，對(duì)宏基因組技術(shù)的使用場(chǎng)景和技術(shù)方法提出建議。為了更好的推進(jìn)方法的臨床可及性，應(yīng)在有技術(shù)實(shí)力的醫(yī)院開展臨床應(yīng)用研究，不斷優(yōu)化相關(guān)技術(shù)方法。適應(yīng)當(dāng)前的診療模式，規(guī)范化的開展多層多種技術(shù)的覆蓋，在大醫(yī)院、社區(qū)、家庭和重點(diǎn)場(chǎng)所分層次地配備適合的檢測(cè)方法和手段，有助于更高效的提高病原檢測(cè)能力。

（一）多組學(xué)整合分析

在關(guān)注患者感染病原學(xué)的診斷同時(shí)，多樣化技術(shù)手段的應(yīng)用，可同時(shí)獲得人體、微生物組以及病毒組的組成數(shù)據(jù)。結(jié)合新的模型算法，有助于從多組學(xué)角度探索臨床精準(zhǔn)診療標(biāo)識(shí)。在2018年發(fā)表的一項(xiàng)研究中，基于多組學(xué)整合分析，可以通過宏基因組和人體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來區(qū)分下呼吸道感染，陰性預(yù)測(cè)的能力已經(jīng)達(dá)到了100%[14] 。

（二）人工智能技術(shù)

2020年《細(xì)胞》雜志上發(fā)表可利用人工智能的方法去輔助做新冠肺炎的診斷，其準(zhǔn)確率、靈敏度、特異性都很好[15]。但這一技術(shù)的使用、其算法和模型是否具有泛適性，還需要更多的數(shù)據(jù)支撐。

（三）系統(tǒng)生物學(xué)

在鑒定感染性疾病病原時(shí)，既要關(guān)注感染病例的臨床轉(zhuǎn)歸和結(jié)局，也要警醒是否存在新病原。而同樣，在新發(fā)突發(fā)病原導(dǎo)致的新發(fā)突發(fā)傳染病防控上，需要要兼顧考慮到病原體本身和被感染宿主，這恰恰就是大數(shù)據(jù)組合帶來的優(yōu)勢(shì)。未來，數(shù)據(jù)的組合分析和新型的算法，會(huì)為我們?cè)诤粑蹈腥拘约膊〉脑\斷，尤其是其精準(zhǔn)的診斷上提供更多的思路和參考。

（四）小結(jié)

1、明確呼吸道感染病原譜組成特征可為推進(jìn)病原病因?qū)W診斷提供關(guān)鍵基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；

2、住院肺炎病例病原學(xué)診斷的檢測(cè)頻次，重視住院期間呼吸道病毒等共感染對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響；

3、宏基因組病原檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景以及結(jié)果解讀，要充分考慮到它適應(yīng)性；

4、人體多組學(xué)研究成果的積累以及人工智能的發(fā)展等將為感染病原學(xué)的精準(zhǔn)診斷提出更多的創(chuàng)新性診斷策略和方法。

本文完，排版：Jerry