滅活疫苗是疫苗中使用得比較普遍和研究過(guò)程較為簡(jiǎn)單的一種。它是將死亡的病毒輸入人體中，促使人體產(chǎn)生抗體。當(dāng)人們?cè)儆龅交畹牟《緯r(shí)就不會(huì)感染。
　　
　　研究滅活疫苗首先要鑒定病原，找到病毒，并在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)出大量的病毒。提純后再通過(guò)化學(xué)方法滅活，也就是“殺死”它們，做成滅活疫苗。然后將滅活疫苗（死的病毒）輸入動(dòng)物做免疫實(shí)驗(yàn)，判斷疫苗的安全性；如果安全性沒(méi)有問(wèn)題，還得做效力實(shí)驗(yàn)，即把活的病毒輸入已注射疫苗的動(dòng)物體內(nèi)后，如果動(dòng)物沒(méi)有生病或死亡，則說(shuō)明產(chǎn)生了抗體并起到了作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還包括各種毒副作用實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)成功后才能考慮在臨床上使用。
　　
　　想做出一個(gè)效果好的疫苗，整個(gè)過(guò)程仍然需要不少時(shí)間。就拿動(dòng)物安全實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，一種安全有效的疫苗必須在敏感動(dòng)物身上做安全實(shí)驗(yàn)和效力實(shí)驗(yàn)，人用疫苗還必須用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物做上述實(shí)驗(yàn)，僅這一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少需要幾個(gè)月時(shí)間。
　　
　　和其它種類(lèi)的疫苗相比，滅活疫苗研制的周期最短，方法也最簡(jiǎn)單。

滅活疫苗常用滅活劑
β-丙內(nèi)酯(β-PL)：廣泛用于病毒及滅活疫苗的研制和生產(chǎn)。做滅活劑使用。如用β-丙內(nèi)酯應(yīng)使用95%以上濃度的新試劑，β-丙內(nèi)酯保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起自身聚合，影響滅活效果。我國(guó)制備狂犬病疫苗時(shí)采用甲醛溶液滅活，甲醛為致癌物，殘留的游離甲醛隨疫苗注入人體后產(chǎn)生制激性反應(yīng)。β-丙內(nèi)酯由于能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，因此可考慮在純化前低劑量預(yù)滅活一次，提高生產(chǎn)工序時(shí)的安全性，在純化后再滅活一次以確保完全滅活.
BPL在國(guó)外已廣泛用于各種疫苗的滅活。它是一種雜環(huán)類(lèi)化合物(C3H4O2)，沸點(diǎn)155℃，常溫下是無(wú)色粘稠狀液體，對(duì)病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，其機(jī)理為改變病毒RNA結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的。β-丙內(nèi)酯殺滅病毒的作用很強(qiáng)，1 g/L β-丙內(nèi)酯，在37℃作用2小時(shí)后即可殺滅血漿 中的 西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、淋巴脈絡(luò)叢腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、狂犬病病毒等 。到目前為止，以流感病毒、豬瘟病毒、腺病毒、乙肝病毒、痘病毒、黃熱病毒、微小RNA 病毒、皰疹病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉腦炎病毒、狂犬病病毒、鼠 腦炎病毒等作試驗(yàn)，β-丙內(nèi)酯氣體均能有效地將其殺滅，一般認(rèn)為，β-丙內(nèi)脂氣體殺 滅病毒的有效濃度為5～30mg/L。低濃度的β-丙內(nèi)酯(2～4 mg/L)可以破壞病毒核酸，但不改變病毒蛋白質(zhì)，因此也是滅活疫苗 制造中很常用的病毒滅活劑。實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)病毒材料的種類(lèi) 和狀態(tài)，應(yīng)用正確濃度、使用方法、作用時(shí)間、溫度等等。

甲醛和戊二醛
甲醛及其37～40％溶液即福爾馬林，是病毒學(xué)中普遍應(yīng)用的一種病毒滅活 劑，在滅活疫苗的制造中尤為常用。甲醛對(duì)病毒核酸和病毒蛋白質(zhì)都有破壞作用，但首先 是使 病毒核酸滅活——與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的堿基結(jié)合而使病毒核酸變性。甲 醛較高濃度和較長(zhǎng)時(shí)間的作用，可與病毒蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合而形成羥甲基衍生物或二羥甲基 衍生物，后者再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。病毒蛋白質(zhì)因而變性，阻止病 毒核酸的逸出。
甲醛對(duì)單鏈核酸最為有效 ，故常用于RNA病毒的滅活。適當(dāng)濃度的甲醛滅活病毒后，病毒抗原性、血凝性均不改變，故常用其滅活病毒制造疫苗， 迄今應(yīng)用的滅活病毒疫 苗，約有50%以上是用甲醛作滅活劑，通常應(yīng)用0.05%～0.1%～0.2%濃度的福爾馬林。其 它病毒制品如血凝抗原、補(bǔ)體結(jié)合抗原、瓊擴(kuò)抗原也常以甲醛滅活病毒制備。
戊二醛對(duì)病毒的作用與甲 醛相似，但滅活作用更強(qiáng)，2%堿性戊二醛溶液在1分鐘內(nèi)能殺滅所有病毒。在病毒學(xué)中，戊 二 醛常用于實(shí)驗(yàn)室污染器材如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)的擦拭消毒。用強(qiáng)化酸性戊二醛(含0.25 乙烯脂肪醇醚)代替常用的3%～5%石炭酸溶液浸泡污染的吸管、試管等，具有可靠的消毒效果。
病原菌的分離鑒定及其疫苗的制備
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

熟悉水產(chǎn)細(xì)菌性病原的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定的基本方法，了解所分離細(xì)菌性病原的形態(tài)特征及培養(yǎng)特點(diǎn)，了解細(xì)菌性滅活疫苗制備的基本過(guò)程。

二、實(shí)驗(yàn)材料

患白內(nèi)障病虎紋蛙（或其他患細(xì)菌性疾病的水產(chǎn)動(dòng)物）、健康虎紋蛙、腦膜炎敗血黃桿菌（虎紋蛙白內(nèi)障病的病原）

三、實(shí)驗(yàn)藥品、用具

2216E 瓊脂平板、 2216E 瓊脂斜面、福爾馬林、無(wú)菌蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖液、接種環(huán)、解剖刀、剪刀、鑷子、滴管、紗布、白瓷盤(pán)、酒精棉球、滅菌試管、 96 孔板、注射器、酒精燈、離心機(jī)（包括離心管）、水族箱、記號(hào)筆、

四、實(shí)驗(yàn)操作程序

（一）病原菌的分離與鑒定

1 ．培養(yǎng)基的制備

（ 1 ）普通肉湯培養(yǎng)基：

按以下劑量稱(chēng)取各種試劑（先稱(chēng)取鹽類(lèi)再稱(chēng)蛋白胨及牛肉膏），置于鋁鍋或搪瓷缸中。

牛肉膏 5g 磷酸氫二鉀 1g

蛋白胨 10g 蒸餾水 1000ml

氯化鈉 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6

初配好的培養(yǎng)基呈酸性故要用 NaOH 調(diào)整。將 pH 測(cè)定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過(guò)濾，將過(guò)濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。

（ 2 ）普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

普通肉湯 1000ml

瓊脂 20g

瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類(lèi)物質(zhì)，對(duì)病原性細(xì)菌無(wú)營(yíng)養(yǎng)作用，但在水中加溫可融化，冷卻后可凝固。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培養(yǎng)基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％則成半固體培養(yǎng)基。

將稱(chēng)好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將 pH 調(diào)至 7 . 4 ～ 7 . 6 。瓊脂融化過(guò)程中需不斷攪拌，并控制火力，不使培養(yǎng)基溢出或燒焦，并注意補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

加熱溶解好的培養(yǎng)基可用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，固體培養(yǎng)基要用 4 層紗布趁熱過(guò)濾（切勿使培養(yǎng)基凝固在紗布上），之后按實(shí)驗(yàn)要求，將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶中，包扎好待滅菌，將培養(yǎng)基置于高壓蒸汽鍋內(nèi)， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成高層瓊脂。

鹽水瓶中的普通瓊脂以手掌感觸，若將瓶緊握手中覺(jué)得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度（ 50 ～ 60 ℃ ），每只滅菌培養(yǎng)皿倒入約 15 ～ 20ml ，將皿蓋蓋上，并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。

培養(yǎng)基中的某種成分，如血清、糖類(lèi)、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應(yīng)過(guò)濾除菌，再按規(guī)定的量加入培養(yǎng)基中。

2 ．病原菌的分離與培養(yǎng)

分離病原菌的材料要求是具有典型患病癥狀的活的或剛死不久的患病生物，病原菌的分離方法如下。

體表分離：先將病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或 用經(jīng)酒精燈灼燒的解剖刀燙燒消毒，再 用接種環(huán)刮取病灶深部組織或直接挑取部分深部患病組織，接種于普通肉湯培養(yǎng)基增菌或直接在普通瓊脂平板上劃線(xiàn)分離。

內(nèi)部組織器官：用 70 ％酒精浸過(guò)的紗布覆蓋體表或用酒精棉球擦拭，進(jìn)行體表消毒，無(wú)菌打開(kāi)病魚(yú)的腹腔，以肝、腸、心臟等臟器為材料， 先將擬分離病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用 經(jīng)火焰上灼燒后的解剖刀燙燒，以殺死表面的雜菌，隨即在燒灼部位刺一小孔，用滅菌的接種環(huán)（待冷 2 ～ 5 秒）伸向燒灼部小洞中，用手指將接種環(huán)輕輕旋轉(zhuǎn)兩次，借以達(dá)到取足材料的目的。左手持握普通瓊脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接種環(huán)在瓊脂平板上分區(qū)劃線(xiàn)接種。劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)面與平板表面成 30 ～ 40 度的角輕輕接觸，在平板表面輕快地移動(dòng)，接種環(huán)不應(yīng)嵌入培養(yǎng)基內(nèi)，且不要重復(fù)，否則形成菌苔。劃線(xiàn)完畢，蓋上皿蓋，接種環(huán)滅菌后放下，并在平皿底部用記號(hào)筆注明接種材料、日期及操作者代號(hào)。也可對(duì)實(shí)質(zhì)性臟器用無(wú)菌剪刀下一小塊，用鑷子夾住病料使其剖面接觸潔凈的玻片，作多個(gè)觸片，染色后在顯微鏡下直接鏡檢，能快速獲得結(jié)果。

鰓部：用無(wú)菌接種環(huán)刮取鰓上的分泌物劃平板。

血液及體液：用無(wú)菌注射器吸取病魚(yú)血液和體液，滴于平板涂布；或用滅菌后的接種環(huán)挑取血液和體液后于平板上劃線(xiàn)，分離細(xì)菌。

接種后的平板經(jīng) 30 ℃ 左右培養(yǎng) 24 ～ 72h 后， 檢查菌落生長(zhǎng)情況，對(duì)菌落檢查的主要內(nèi)容包括：

（ 1 ）大?。浩浯笮∫?mm 表示，微小菌落：針尖大，直徑小于 0 . 5mm ，如支原體菌落、豬丹毒桿菌菌落；小菌落：直徑在 0 . 5 ～ 1 mm 之間，如嗜血桿菌、布氏桿菌菌落；中等大小的菌落：直徑在 1 ～ 3 mm 之間，如巴氏桿菌、沙門(mén)氏桿菌菌落；大的菌落：直徑大于 3mm ，如炭疽芽孢桿菌菌落等。

（ 2 ）形態(tài)：圓形，不規(guī)則形（根狀、樹(shù)葉狀）

（ 3 ）邊緣：整齊，不整齊（鋸齒狀、蟲(chóng)蝕狀、卷發(fā)狀）

（ 4 ）表面：光滑、粘液狀、粗糙、荷包蛋狀、漩渦狀、顆粒狀

（ 5 ）隆起度：隆起，輕度隆起，中央隆起，平升狀、扁平狀，臍狀（凹陷狀）

（ 6 ）顏色：無(wú)色、灰白色、白色、金黃色、紅色、粉紅色

（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明

（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血

根據(jù)菌落數(shù)量和特征，挑選可能的病原菌菌落進(jìn)一步劃線(xiàn)純化 1 ～ 2 次后，將經(jīng)純化的可能病原菌用于感染試驗(yàn)。

3 ．病原菌的確定

將從患病材料中分離的所有可能病原菌經(jīng)純化和擴(kuò)大培養(yǎng)后分別進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。目前最常用的人工感染接種方法有浸泡、口服和注射法等，究竟選用哪一種方法最合適，需要根據(jù)不同的疾病類(lèi)型和可能的侵入途徑而定。如體表的病，可采用浸泡法（包括創(chuàng)傷浸泡）；體內(nèi)的疾病，可采用口服、注射法。由于絕大部分病原菌都是條件致病菌，因此在人工感染實(shí)驗(yàn)時(shí)還要注意感染菌的用量，接種量過(guò)大，即使該菌并不是引起實(shí)驗(yàn)材料致病的病原菌，也可能會(huì)因大量菌體裂解釋放的大量?jī)?nèi)毒素而使感染生物死亡，為了量化感染菌的危害程度，可以測(cè)定感染細(xì)菌對(duì)接種動(dòng)物的半數(shù)致死量（ LD 50 ），根據(jù) LD 50 的大小來(lái)判斷其致病力的強(qiáng)弱。只有 LD 50 相對(duì)較低、感染引起的死亡與實(shí)驗(yàn)材料有相同癥狀、并且經(jīng)回接實(shí)驗(yàn)還能分離到相同的細(xì)菌時(shí)，才能確定所分離的細(xì)菌為引起實(shí)驗(yàn)材料致病的病原 。

在感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，感染對(duì)象要求是 沒(méi)有患病史的同種生物，在感染前要經(jīng)過(guò) 1 ～ 2 周的暫養(yǎng)，感染數(shù)量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。必要時(shí)，還要將溫度控制在適合疾病爆發(fā)的水平 。感染過(guò)程中要 定時(shí)投餌和換水，同時(shí)安排合適的對(duì)照組。

4 ．病原菌的鑒定

分別觀察病原菌的形態(tài)以及檢測(cè)其各種生理生化指標(biāo)，通過(guò)查閱伯杰氏手冊(cè)確定病原菌的種類(lèi)；也可直接用細(xì)菌鑒定儀測(cè)定病原菌的種類(lèi)。

（二）疫苗制備

1 ．病原菌的擴(kuò)大培養(yǎng)與分離

液體培養(yǎng)：按配方配制 2216E 液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基用 三角燒瓶分裝并蓋上棉塞后置 于高壓蒸汽鍋內(nèi)， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，冷卻后于超凈工作臺(tái)內(nèi)加入 1ml 左右預(yù)先制備的病原菌菌液，蓋上棉塞，用搖床于 28~ 30 ℃ 下震蕩（約 150rpm ）培養(yǎng) 24~48h 。病原菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后以 3000~5000rpm 離心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸緩沖液）配制成 1% 或 1 ‰左右 的菌懸液。

茄子瓶擴(kuò)大培養(yǎng)：按配方配制 2216E 瓊脂培養(yǎng)基，于高壓蒸汽鍋內(nèi)， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱倒入經(jīng)干熱消毒的茄子瓶?jī)?nèi)（每瓶約 15ml 培養(yǎng)基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超凈工作臺(tái)臺(tái)面，稍予搖動(dòng)使培養(yǎng)基平鋪于瓶壁，冷卻后制成茄子瓶平板。用無(wú)菌滴管吸取預(yù)先制備的病原菌菌液，在每個(gè)茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用經(jīng)灼燒消毒并冷卻的玻璃涂布器將菌液涂布均勻， 28~ 30 ℃ 下培養(yǎng) 24~48h 。用無(wú)菌 PBS 洗脫平板表面的菌苔，洗脫液經(jīng) 3000~5000rpm 離心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸緩沖液）配制成約 1% 或 1 ‰ 的菌懸液。

2 ．滅活

化學(xué)滅活：以福爾馬林作為化學(xué)滅活劑。滅活前先確定福爾馬林對(duì)該病原菌的安全滅活濃度，確定方法為：取 7 支滅菌試管，分別 5ml 加入預(yù)先制備病原菌菌液，其中 6 支裝有菌液的試管分別依次加入一定量的福爾馬林，使福爾馬林的終濃度分別為 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支試管不加入福爾馬林作為對(duì)照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支試管中分別取 0.2ml 菌液于 2216E 瓊脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培養(yǎng) 48h ，檢測(cè)各試管內(nèi)細(xì)菌的存活情況，只有沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)福爾馬林濃度才是該病原菌的滅活安全濃度。向第 1 步中制備的 1% 菌懸液內(nèi)添加福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達(dá)到安全滅活濃度以上， 于 4 ℃ 下放置 24h ，制備滅活菌液。

其他滅活方法：除化學(xué)滅活，疫苗制備時(shí)還可采用熱滅活、紫外線(xiàn)和超聲波滅活等方法。

3 ．安全性檢測(cè)

活性檢測(cè)：取 0.2ml 滅活菌于 2216E 瓊脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培養(yǎng) 48h ，只有在瓊脂平板上沒(méi)有出現(xiàn)菌落出現(xiàn)才說(shuō)明滅活徹底，滅活菌液中確實(shí)沒(méi)有活菌存在。

安全檢測(cè)：將所制備的滅活菌液稀釋成疫苗接種所用的濃度（一般為 10 8 cfu ），用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，經(jīng) 20d 觀察無(wú)發(fā)病或死亡才說(shuō)明該滅活細(xì)菌是安全的。

4 ．效果檢測(cè)

抗體效價(jià)檢測(cè)：用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到 無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖 2 個(gè)月，從第 10d 開(kāi)始每隔 10d 取 3 尾以上接種生物用 微量血凝板法檢測(cè)其平均凝集抗體效價(jià) ?？贵w效價(jià)檢測(cè)方法為：抽取感染動(dòng)物血液并離心分離血清，用取樣器吸取 0.1ml 血清加入經(jīng)滅菌的 96 孔板的 A1 孔內(nèi)，在 96 孔板 A 行的其他孔內(nèi)加入 0.05ml 無(wú)菌 PBS ，從 A1 孔內(nèi)取 0.05ml 血清加入 A2 孔內(nèi)，混勻后再?gòu)?A2 孔內(nèi)取 0.05ml 液體加入 A3 孔內(nèi) …… ，如此重復(fù)，使 96 孔板內(nèi)后 1 個(gè)孔內(nèi)的血清濃度均比前 1 個(gè)孔低 1 倍（倍釋法），再在 96 孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入 0.05ml 菌液（活的或滅活的均可）， 37 ℃ 孵育過(guò)夜后觀察（最好在 96 孔板下墊一張黑紙以增加反差），出現(xiàn)沉淀的最高血清稀釋倍數(shù)即為血清中所含抗病原菌抗體的效價(jià)。比較不同時(shí)期內(nèi)抗體效價(jià)的變化情況，確定最高抗體效價(jià)值。一般情況下，抗體效價(jià)越高，滅活細(xì)菌作為疫苗的效果就最好。

攻毒感染實(shí)驗(yàn)：選擇 無(wú)患病史的同種同齡寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）作為感染對(duì)象，用注射法進(jìn)行攻毒感染。 用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到 無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖 2 個(gè)月，從第 20d 開(kāi)始每隔 20d 取 10 尾以上接種生物用 活的病原菌進(jìn)行感染，感染方法為： 。

（二）致病菌的人工感染

1) 實(shí)驗(yàn)材料：嗜水氣單胞菌斜面（每組 2 支），試管架（ 1 個(gè)）酒精棉球（ 1 瓶），無(wú)菌生理鹽水，滅菌空試管，麥?zhǔn)媳葷峁堋?/span>

2 ）實(shí)驗(yàn)方法：用裝有針頭的注射器（或無(wú)菌吸管），吸取無(wú)菌生理鹽水，滴注到培養(yǎng)有嗜水氣單胞菌的斜面上，振蕩使斜面上的菌落洗下（或用滅菌接種環(huán)輕輕刮下），倒入滅菌空試管中，用無(wú)菌生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)菌濃度，與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比色，使菌濃度達(dá)到 2.1×10 9 個(gè)細(xì)菌 /ml （ 21 億），用滅菌注射器抽取菌懸液，待人工感染時(shí)用。注射部位在魚(yú)的背鰭前端與側(cè)線(xiàn)之間的中部區(qū)域。用酒精棉球在注射部位擦拭進(jìn)行體表消毒后進(jìn)行肌肉注射。針尖斜向魚(yú)的頭部，與魚(yú)體成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾魚(yú)注射量為 0.6 ml ，每天觀察魚(yú)的發(fā)病及癥狀等情況并做好記錄。
第一節(jié) 病毒的生產(chǎn)制備

病毒需在活的敏感細(xì)胞中才能增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不成熟之前，人們?yōu)檠芯坎《荆捎秒u胚接種或動(dòng)物接種的方法來(lái)分離、鑒定病毒或制備一定量的病毒液，但這種方法因個(gè)體和種屬差異，不僅許多病毒難以找到合適的敏感動(dòng)物，而且即使在敏感動(dòng)物中繁殖，往往個(gè)體差異大而影響結(jié)果的判定，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，首先在病毒學(xué)研究方面獲得了廣泛的應(yīng)用，為病毒的繁殖、鑒定提供了來(lái)自不同動(dòng)物（包括人）、不同組織的細(xì)胞來(lái)源，通過(guò)敏感性篩選，目前絕大多數(shù)病毒均可有相應(yīng)的敏感細(xì)胞，為病毒的分離、鑒定和增殖創(chuàng)造了條件。同時(shí)也為病毒的大量生產(chǎn)提供了細(xì)胞來(lái)源，隨著細(xì)胞大量生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，因此對(duì)病毒來(lái)說(shuō)只要有敏感的細(xì)胞，就可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
一、病毒生產(chǎn)的目的和用途
1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制備免疫血清（抗體）。
2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預(yù)防接種。
3、為了生產(chǎn)基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療及基因疫苗的預(yù)防接種。
4、為了制備干擾素的病毒誘生劑（NDV、仙臺(tái)病毒等），用于干擾素的生產(chǎn)。
5、生物戰(zhàn)用的病毒生物戰(zhàn)劑。常選用毒力強(qiáng)、抵抗力強(qiáng)、對(duì)不同國(guó)家人群最敏感的病毒，又能通過(guò)氣溶膠或昆蟲(chóng)和污染的水土進(jìn)行傳播的病毒。這是戰(zhàn)爭(zhēng)狂們正在開(kāi)展的研究，應(yīng)警惕。
二、病毒生產(chǎn)制備的方法
1、動(dòng)物接種，如狂犬病毒、腦炎蟲(chóng)媒病毒采用鼠、兔腦內(nèi)接種后收取腦組織制成懸液。
2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙臺(tái)病毒等，目前尚無(wú)敏感細(xì)胞，常采用9～10日胚齡的尿囊腔接種，37℃孵育72小時(shí)收獲尿液，用雞紅血球測(cè)定血凝效價(jià)。Q熱用7日齡鴨胚進(jìn)行卵黃囊接種收獲卵黃囊，馬腦炎病毒常采用10日齡雞胚體接種，收獲全胚體液等。
3、細(xì)胞培養(yǎng)法（詳見(jiàn)第二篇第18章）
不同的病毒選用相應(yīng)的敏感細(xì)胞，采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、多層培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)或懸浮攪拌培養(yǎng)等方法,先大量增殖細(xì)胞，然后接種一定量的病毒,繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間時(shí)，凍融細(xì)胞后，離心收獲上清。
以上病毒大量生產(chǎn)后可制作病毒疫苗（死疫苗或減毒活疫苗），也可用來(lái)作干擾素誘生劑或提取病毒表面抗原成分，但反對(duì)用作生物戰(zhàn)劑，危害人類(lèi)健康和生命。

第二節(jié) 病毒疫苗的生產(chǎn)制備

病毒疫苗的生產(chǎn)制備與病毒的生產(chǎn)制備基本相同，目前進(jìn)行人工主動(dòng)免疫，用于病毒病預(yù)防的疫苗有滅活疫苗（Killed Vaccine）,又稱(chēng)死疫苗，減毒活疫苗（Live Vaccine）,亞單位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的減毒活疫苗，基因工程亞單位疫苗，重組牛痘多價(jià)疫苗。
一、病毒疫苗的種類(lèi)
(一)滅活疫苗：目前常用的有流行性乙型腦炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍體細(xì)胞與地鼠腎細(xì)胞可用于生產(chǎn)狂犬病病毒固定毒滅活疫苗），流感滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，以滅活病毒核酸而不影響其抗原性。
(二)減毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通過(guò)動(dòng)物傳代或細(xì)胞傳代篩選對(duì)人毒力低的變異株病毒。常用的有脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗）。
(三)亞單位疫苗：用化學(xué)試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以此制成的疫苗稱(chēng)亞單位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神經(jīng)氨酸酶亞單位疫苗。
(四)多肽疫苗：采用乙肝攜帶者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制備的HBsAg基因表達(dá)產(chǎn)物制備的疫苗。
(五)基因缺失的減毒活疫苗：在病毒的基因組中，使其有毒力的相關(guān)基因發(fā)生缺失而制成的減毒活疫苗稱(chēng)基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3區(qū)缺失株（第二代），單純皰疹病毒的α22基因缺失株，目前有待進(jìn)一步研究。
(六)基因工程亞單位疫苗：將病毒表面抗原基因，通過(guò)基因重組，在酵母或CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)亞單位多肽抗原成分而制成的疫苗，稱(chēng)基因工程亞單位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和CHO細(xì)胞中表達(dá)而提取獲得的純品HBsAg多肽。即將上市。
(七)重組牛痘多價(jià)活疫苗。以牛痘苗為載體來(lái)表達(dá)數(shù)十種外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，經(jīng)基因重組后而制成的牛痘苗病毒，經(jīng)一次劃痕接種可使機(jī)體同時(shí)能獲得對(duì)多種病毒的免疫力，大大減少了接種次數(shù)。此外腺病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組后的活疫苗，經(jīng)口服后可同時(shí)獲得兩種病毒的免疫力，有待于進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)。
上述病毒疫苗有的是采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞工程來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)制備的，現(xiàn)將采用細(xì)胞工程制備病毒疫苗種類(lèi)和敏感細(xì)胞以及生產(chǎn)方式規(guī)于下表。
二、細(xì)胞培養(yǎng)法制備的常用疫苗（如表25-1）。

表25-1 采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的常用病毒疫苗
疫 苗  制備疫苗
的 細(xì) 胞  培養(yǎng)方法
名 稱(chēng)  活/死(疫苗株)    
脊 髓 灰  滅活（Salk株）  猴腎細(xì)胞（原代/2-3代）  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
質(zhì)炎疫苗  活（Sabin株）  Vero細(xì)胞  微載體培養(yǎng)
      
腮 腺 炎  活（ME株）  幼地鼠、狗腎  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
疫 苗    豚鼠腎細(xì)胞  羅氏瓶培養(yǎng)
      
麻疹活疫苗   Edomonste、
L16、滬191、
Moraten、
Schwar2株
  原代雞胚纖維母
細(xì)胞，人二倍體
人羊膜、狗腎、羊腎
豚鼠腎細(xì)胞  
羅氏瓶培養(yǎng)
轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
單純瘡疹  死（72株）  兔腎、豚鼠腎  羅氏瓶培養(yǎng)
病毒疫苗    豚鼠胚成纖維細(xì)胞  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
      
巨細(xì)胞病毒疫苗  活（Towne株）  WI-38人胚肺細(xì)胞  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)
      
狂犬病毒疫苗  死（**01/**02株）
（CUS株）  人二倍體細(xì)胞  微載體培養(yǎng)
      
流行性乙型
腦炎疫苗  滅活（5-3株）  人二倍體細(xì)胞  多層滋養(yǎng)增殖器
      
森林腦炎
病毒疫苗  滅活  雞胚纖維母細(xì)胞
幼地鼠腎細(xì)胞  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

三、用細(xì)胞培養(yǎng)制備病毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)：
病毒疫苗的制備開(kāi)始多用動(dòng)物臟器、禽類(lèi)胚胎（第一代疫苗）。然而因來(lái)源困難，很不經(jīng)濟(jì)，制作麻煩，數(shù)量受限，更危險(xiǎn)的是這些組織中間可能含有潛在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代細(xì)胞來(lái)制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙腦疫苗等，隨著細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，特別是自70年代后我國(guó)二倍體細(xì)胞株相繼建立，為疫苗生產(chǎn)創(chuàng)造了極為有利的基礎(chǔ)，這比用原代細(xì)胞制備疫苗更優(yōu)越。如：
（1）在細(xì)胞傳代期間可進(jìn)行比較全面的檢查，特別是對(duì)潛在病毒和致癌性的檢查，確保安全。
（2）可使逐漸適應(yīng)于無(wú)血清（或無(wú)蛋白）培基中生產(chǎn)繁殖，以排除過(guò)敏因素。
（3）可挑選對(duì)病毒敏感的細(xì)胞克隆。以利病毒在細(xì)胞中大量增殖，有助于疫苗產(chǎn)量的提高。
（4）易于大量生產(chǎn)和進(jìn)行連續(xù)自動(dòng)化工業(yè)生產(chǎn)，以滿(mǎn)足量的需求。
國(guó)外已建立的二倍體細(xì)胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，國(guó)內(nèi)已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生產(chǎn)，如麻疹活疫苗、乙型腦炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腮腺炎疫苗等，從目前發(fā)展來(lái)看，用二倍體細(xì)胞制備疫苗將有取代其他原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的趨勢(shì)，但目前仍有一些病毒疫苗的制備還需用原代細(xì)胞，近年來(lái)有人主張用腫瘤細(xì)胞制備人用滅活疫苗。
四、提高疫苗的效力常采用的方法：
（1）細(xì)胞的藥物處理：用某些藥物處理細(xì)胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法為：在細(xì)胞形成單層后，用一些化學(xué)藥物來(lái)處理，然后洗去，再接種病毒，就可使病毒提前成熟，產(chǎn)量高，現(xiàn)列表如下：

處理細(xì)胞的藥物  刺激的病毒
5-碘-2-脫氧尿核甙  風(fēng)疹、腺病毒、巨細(xì)胞病SV-40
維生素A或Tween-80  脊髓灰質(zhì)炎病毒、濾泡性口腔炎病毒
膽固醇或卵磷質(zhì)  脊髓灰質(zhì)炎病毒
DEAE-dextran  脊髓灰質(zhì)炎病毒、風(fēng)疹痘類(lèi)病毒，付流感病毒
胰 酶  痘類(lèi)病毒、呼吸道腸道病毒，流感病毒、鼻病毒
二甲亞砜  脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感、皰疹病毒
放線(xiàn)菌素D  麻疹、脊髓灰質(zhì)炎病毒、付流感病毒

（2）在維持液中補(bǔ)充某些物質(zhì)也有利于某些病毒的復(fù)制、列表如下：
增 加 的 藥 物  刺 激 的 病 毒
Tween-80或油酸鈉  乙型腦炎
谷氨酰胺  麻疹、脊髓灰質(zhì)炎病毒、仙臺(tái)病毒
精氨酸  痘類(lèi)病毒、皰疹病毒
脯氨酸、賴(lài)氨酸  乙型腦炎

（3）毒種的選擇：經(jīng)過(guò)空斑挑選產(chǎn)量高的大空斑毒株，精制毒種可提高病毒產(chǎn)量。
（4）病毒液的濃縮：經(jīng)濃縮后，病毒濃度增高，從而效價(jià)也隨之上升。
五、影響疫苗質(zhì)量的因素：
（1）毒種：毒種的優(yōu)劣不僅影響疫苗的產(chǎn)量，而且也影響疫苗的質(zhì)量，毒種不純會(huì)產(chǎn)生相互干擾，減毒活疫苗毒種若毒力回升易造成事故，因此毒種的選擇應(yīng)挑選那些致病性低，免疫效價(jià)高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產(chǎn)，可在傳代細(xì)胞上傳代的毒種。
（2）培養(yǎng)病毒的細(xì)胞：細(xì)胞若有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不能用作疫苗生產(chǎn)。對(duì)此因素應(yīng)嚴(yán)格檢查。此外若細(xì)胞本身發(fā)生轉(zhuǎn)化后，不宜于制備活疫苗，只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。
（3）培養(yǎng)液：培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會(huì)出現(xiàn)某種程度的過(guò)敏反應(yīng)，為此，應(yīng)盡量使細(xì)胞適應(yīng)于無(wú)血清蛋白的培養(yǎng)基中，以消除過(guò)敏源。
（4）甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來(lái)制備滅活病毒疫苗，但要控制含量。
病毒被滅活的程度與滅活的溫度和甲醛的濃度等因素有密切關(guān)系。一般用熱滅活的方法，采用在37℃滅活一定時(shí)間。經(jīng)熱滅活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和穩(wěn)定性不受影響，而且滅活病毒的溫度提高以后，滅活時(shí)間相對(duì)可以縮短，滅活劑的用量也可以減少。
甲醛能刺激局部而引起疼痛和紅腫，并有釋放組織胺的作用。因此制備疫苗時(shí)減少甲醛濃度是必要的。如果疫苗內(nèi)游離甲醛含量降低到一定程度后，可考慮不需再用亞硫酸氫鈉來(lái)中和甲醛。這對(duì)減少注射后疼痛及便于推廣預(yù)防接種有重要意義。
六、生產(chǎn)病毒和制備病毒疫苗的常用方法
(一)制備工藝流程
（1）脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗制備工藝

猴 腎 細(xì) 胞 培 養(yǎng)
  ←接種病毒（測(cè)0%正常細(xì)胞對(duì)照）
收獲病毒，合并，加MgCl2→  
無(wú)菌試驗(yàn)→  ←猴病毒檢查（獲腎細(xì)胞）（SV40）
B病毒檢查（兔腎細(xì)胞）→  ←病毒效價(jià)滴定
  ←合并，過(guò)濾加MgCl2
  ←無(wú)菌試驗(yàn)
分亞批→  ←柯薩奇病毒檢查（乳鼠）
病毒滴定→  ←型特異性檢查
B病毒復(fù)檢（家兔）→  ←T特征試驗(yàn)
分裝病毒滴定→  ←猴體殘余致麻痹力試驗(yàn)
（安全試驗(yàn)）病理切片
結(jié)核桿菌檢查→  
分裝→  ←無(wú)菌試驗(yàn)
病毒滴定→  
→  保存于-20℃待檢定合格后
加 工 糖 丸
脊髓灰質(zhì)炎活疫菌工藝流程

2、流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝
地 鼠 腎
剪碎，胰酶消化
地鼠腎細(xì)胞懸液
37℃,3天 細(xì)胞培養(yǎng)液，pH7.0～pH7.2
單層細(xì)胞
洗滌細(xì)胞，去除牛血清
10-4～10-5濃度病毒感染細(xì)胞
32～34℃培養(yǎng)2～3天
收獲病毒液（收二次）
按1:2000加入甲醛
22℃，8天
滅活病毒液
合并，安全及效力試驗(yàn)
原液
加入亞硫酸氨鈉
半成品
分裝
成品
檢定(包括理化性質(zhì)，無(wú)菌試驗(yàn)、安全試驗(yàn)，
防腐劑、試劑及殘余牛血清含量等）
合格成品

(二)生產(chǎn)方法：
病毒和病毒疫苗的生產(chǎn)方法基本相同，其規(guī)模取決于細(xì)胞生產(chǎn)規(guī)模，因此上述介紹的細(xì)胞大量生產(chǎn)的方法和工藝均可用來(lái)生產(chǎn)病毒和病毒疫苗，可根據(jù)需要及適宜生產(chǎn)條件來(lái)選用培養(yǎng)裝置，如轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，因設(shè)備簡(jiǎn)單，便于生產(chǎn)單位采用。而多層培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，目前國(guó)外已用于生產(chǎn)，我國(guó)仍在研究中。懸浮攪拌培養(yǎng)的簡(jiǎn)易裝置已應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)，全自動(dòng)懸浮發(fā)酵罐，在干擾素生產(chǎn)中有應(yīng)用，但在疫苗生產(chǎn)中正在試用，下面著重介紹微載體培養(yǎng)法生產(chǎn)病毒的技術(shù)。
1、微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的病毒生產(chǎn)工藝
作者選VSV病毒來(lái)接種經(jīng)微載體培養(yǎng)的敏感細(xì)胞，病毒的效價(jià)測(cè)定用A549細(xì)胞（也可用Wish或Hep-2細(xì)胞或雞胚纖維母細(xì)胞測(cè)TCID50），病毒的效價(jià)為6 Log TCID50/m  L，用雞胚細(xì)胞空斑法測(cè)定一般為107Pfu/mL。
①VSV在方瓶貼壁細(xì)胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培養(yǎng)基）待BHK21、BHK13、CHO-K1細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，棄上清加入10-2VSV病毒懸液0.2ml，37℃吸附1小時(shí)，加病毒維持液培養(yǎng)20小時(shí)，于-30℃凍存，待測(cè)效價(jià)。
②VSV在微載體懸液培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖。
微載體培養(yǎng)的BHK21或BHK13、或CHO-K1細(xì)胞，
3～4天后細(xì)胞密度已達(dá)1×106細(xì)胞/mL
靜置30分鐘
盡量吸去原培養(yǎng)基
37℃
將10-2VSV病毒按50mL培養(yǎng)體積加入1mL病毒液于微載體細(xì)胞中
37℃ 50r/min攪拌5分鐘
靜置吸附1小時(shí)（每20分鐘攪拌2分鐘）

加入病毒維持液至原體積
37℃繼續(xù)攪拌培養(yǎng)20小時(shí)
于-30℃凍融后
2000 r/min 低溫離心10分鐘
收集上清，即為VSV增殖的病毒液，分裝凍存，待測(cè)效價(jià)

結(jié)果，在微載體懸浮培養(yǎng)的三株細(xì)胞所繁殖VSV病毒不僅產(chǎn)量大，而且病毒效價(jià)平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效價(jià)最高，平均可達(dá)7.75logTCID50比原先的毒種效價(jià)還要高1.75LogTCID50，又起到了提高病毒效價(jià)的作用。
此方法也可應(yīng)用于生產(chǎn)病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感細(xì)胞能在微載體上大量生產(chǎn)。若疫苗株是減毒活疫苗株，此法生產(chǎn)的病毒可直接制備活疫苗。若疫苗株為非減毒活疫苗株，此法生產(chǎn)的病毒可用甲醛滅活法制備死疫苗。
2、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法
此法是目前各大生物制品研究所常用于生產(chǎn)疫毒疫苗的方法，如生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。
將細(xì)胞制備成懸液后，在溫室內(nèi)（37℃）使支架以8～12轉(zhuǎn)/小時(shí)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，以使細(xì)胞貼壁，當(dāng)加入病毒后，待細(xì)胞出現(xiàn)+++以上細(xì)胞病理性改變(CPE)時(shí)，標(biāo)志病毒已大量繁殖，此時(shí)收獲病毒，按生物制品程序加工成疫苗。
3、羅式瓶培養(yǎng)
將許多大羅氏瓶，在凈化室內(nèi)，把制備好的細(xì)胞懸液人工加入瓶?jī)?nèi)，100mL/瓶，在溫室內(nèi)的貨架上一排排放置，進(jìn)行靜置貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層后，倒去舊液，加含病毒疫苗株和維持液，繼續(xù)靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞和記錄溫室的溫度，待細(xì)胞有明顯的CPE產(chǎn)生時(shí)，收獲病毒液，然后按疫苗生產(chǎn)加工工藝制成疫苗。
以上2、3兩種方法是我國(guó)各大生物制品所常規(guī)方法，由于制品工藝的要求，目前仍然采用，但正在不斷改進(jìn)和采用新工藝、新方法和高技術(shù)來(lái)生產(chǎn)疫苗。