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原名：Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies

譯名：單細胞分析確定表達CD19的腦壁細胞是CAR-T免疫治療的潛在非腫瘤靶點

期刊：Cell 

IF：38.637

發(fā)表時間：2020年10月

通訊作者：Ansuman T. Satpathy

通訊作者單位：美國斯坦福大學(xué)

DOI號：10.1016/j.cell.2020.08.022

1   通過scRNA-seq分析在人腦中鑒定CD19⁺腦壁細胞

通過分析來自2364個人類前額皮層細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)（圖1A）。對細胞聚類后，主要分析了非神經(jīng)元，非紅系細胞。按照特異性表達標(biāo)志基因?qū)⑦@些細胞進一步分為星形膠質(zhì)細胞，淋巴細胞，小膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞前體，內(nèi)皮細胞和腦壁細胞群（圖1B-D）。但有少量細胞，表達CD19的同時共表達了CD248（圖1E）。此外，淋巴細胞標(biāo)記基因和腦壁細胞標(biāo)記基因的表達是完全相反的，CD19僅在腦壁細胞內(nèi)特異性表達（圖1F）。為了查看CD19在腦壁細胞中表達的水平，將CD19的表達與已知的腦壁細胞標(biāo)記基因進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD19在基因表達的第86個百分位數(shù)中高表達（圖1G）。

為了驗證CD19是否可以作為腦壁細胞標(biāo)記基因，在其他來自人前額皮層細胞和人腹側(cè)前腦的scRNA-seq數(shù)據(jù)集進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可檢測到CD19（圖2A、2B）。并且CD19在基因表達的第86和第71個百分位中排名較高，表明其表達相對較強（圖2C）。

2   IHC在成人大腦中的CD19表達

為了評估CD19蛋白在人腦壁細胞中的表達，使用人CD19抗體對健康死者腦部樣本進行了幾個區(qū)域的免疫組織化學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在血管周圍區(qū)域鄰近血管基底膜壁的細胞上存在CD19表達（圖3）。在多個大腦區(qū)域，尤其是海馬、島突、顳葉、額葉和頂葉等特定區(qū)域觀察到較高的CD19陽性細胞率。相反，在腦橋和枕葉之類的區(qū)域顯示出較低的CD19陽性細胞率（圖3）。此外，沿著較小的毛細血管和較大的血管也發(fā)現(xiàn)了CD19陽性細胞，這表明，除了腦壁細胞外，CD19還可在血管平滑肌細胞中表達。

圖3. 人腦中CD19的代表性免疫組織化學(xué)染色。

3   周膜細胞和血管平滑肌細胞的分析顯示跨壁細胞的CD19表達

基于前面的IHC染色，表明CD19⁺可能是腦壁細胞的普遍特征，因此用網(wǎng)絡(luò)上能夠獲取的數(shù)據(jù)組成了一個大型scRNA-seq數(shù)據(jù)集，以此來分析腦壁細胞和血管平滑肌細胞的轉(zhuǎn)錄特性。對數(shù)據(jù)進行除雜，然后對細胞進行分群（圖4A）。將同一群細胞匯總在一起，稱之為“元細胞”，其代表該群細胞的平均基因表達。使用這種方式確定了885個元細胞，在885個元細胞中鑒定出高度可變的基因，然后使用這些基因進行降維和聚類（圖4B）。分析表明，CD19在神經(jīng)血管元細胞群中高度表達（圖4C和4D）。元細胞分析沒有顯示出腦壁細胞和內(nèi)皮細胞之間的明確分離（圖4E和4F）。此外，腦壁細胞標(biāo)記基因的表達與CD19的表達密切相關(guān)（圖4G）。在小膠質(zhì)細胞簇中也觀察到了低水平的CD19表達（圖4G和4H）。

結(jié)果表明，根據(jù)CD19可以在這些數(shù)據(jù)中清楚地區(qū)分未分化的祖細胞和分化的腦壁細胞，因為一旦腦壁細胞出現(xiàn)，它們就會表達CD19（圖4E，4F），而且用CD19也可以顯著區(qū)分表達神經(jīng)血管標(biāo)記的元細胞與所有其他元細胞（圖4I），這有利于細胞鑒定。

圖4. 元細胞聚類鑒定人神經(jīng)血管元細胞中的CD19表達。（A）樣品處理方式示意圖；（B）元細胞的UMAP投影，按樣本年齡或群集進行著色；（C）CD19和（D）PAX3的表達；（E）所有樣品中腦壁細胞標(biāo)志物平均表達的直方圖；（F）與（E）中相同的直方圖，但按樣品年齡分開；（G）散點圖顯示壁細胞標(biāo)志物基因與CD19表達的相關(guān)性；（H）元細胞的UMAP投影，由小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物的平均表達著色；（I）基因表達熱圖。

重新分析非神經(jīng)元子集（壁細胞，內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞）并聚類（圖5A和5B），觀察到這些細胞表現(xiàn)出腦壁細胞標(biāo)記物（例如ABCC9和KCNJ8）的大量富集，而沒有ACTA2或其他血管平滑肌細胞標(biāo)記物基因的富集，表明它們代表了真正的腦壁細胞（圖5C）。

使用來自BICCN數(shù)據(jù)集的細胞重復(fù)了此分析，對神經(jīng)血管細胞和相關(guān)祖細胞進行了詳細分析。研究鑒定出了92K個單細胞，分別代表NVU和早期祖細胞（圖4B）。從早期的時間點注意到祖細胞的分叉似乎是神經(jīng)譜系偏向的，而其他的似乎偏向非神經(jīng)元譜系。然后將非神經(jīng)元偏置的祖細胞以及腦壁細胞和內(nèi)皮細胞簇作為子集進行進一步分析。這些26K細胞在CS12–CS15的祖細胞和GW20–GW25的分化的NVU細胞之間有清晰的分離（圖5D和5E）。它們代表了來自許多大腦區(qū)域的細胞（圖5F）。值得注意的是，由于壁細胞比血管平滑肌細胞更為豐富，研究人員在此數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了較小的血管平滑肌細胞群體，這可能是由于BICCN數(shù)據(jù)中的細胞數(shù)量很高（圖5G）。這些細胞顯示出ACTA2和TAGLN的高表達，以及其他腦壁細胞標(biāo)記（如RGS5）的良好表達（圖5H）。重要的是，CD19也在血管平滑肌細胞群體中表達，這與這兩個群體之間的高轉(zhuǎn)錄相似性相一致。這表明CD19表達不是腦壁細胞獨有的，而是人腦壁細胞中的共同特征，與IHC觀察到的染色模式一致（圖3）。注意到，將血管平滑肌細胞群體的身份進一步分配給小靜脈，動脈和小動脈亞群是具有挑戰(zhàn)性的，因為在小鼠中鑒定出的規(guī)范標(biāo)記與該人類數(shù)據(jù)集中鑒定出的亞群并不完全吻合，提示小鼠和人類腦壁細胞之間存在轉(zhuǎn)錄差異。

在BICCN數(shù)據(jù)集中，觀察到壁細胞簇中內(nèi)皮標(biāo)記基因的表達較高，反之亦然。例如，盡管內(nèi)皮細胞和壁細胞簇是可區(qū)分的，但CLDN5和內(nèi)皮細胞標(biāo)記物以及CSPG4的表達比預(yù)期的重疊得多（圖5G）。推測這很可能是由于組織解離過程中這兩種細胞類型的不完全分離，因為緊密相互作用的NVU中的細胞難以完全解離，并且交叉污染很普遍。但是，對先前數(shù)據(jù)集的分析以及對單個BICCN數(shù)據(jù)集的分析顯示，神經(jīng)血管細胞的分離程度更高，并且清楚地表明CD19表達主要在腦壁細胞而不是內(nèi)皮細胞中發(fā)生（圖1F，5B）。

圖5. CD19在腦壁細胞和血管平滑肌細胞中均表達。（A）來自Zhong、La Manno等人的非神經(jīng)元細胞亞群。（B）用于聚類的標(biāo)記基因的表達。顯示了每個基因的最大TPM（y軸）。（C）（左）血管平滑肌細胞標(biāo)記基因的低表達和（右）腦壁細胞標(biāo)記基因的高表達。（D–F）BICCN數(shù)據(jù)的神經(jīng)血管和祖細胞子集。（G）血管平滑肌細胞標(biāo)記（ACTA2）以及CSPG4（腦壁細胞）和CLDN5（內(nèi)皮）標(biāo)記的表達。CD19主要在血管平滑肌細胞和壁細胞簇中表達。（H）軌跡圖顯示缺乏早期發(fā)育標(biāo)志物表達以及血管平滑肌細胞和腦壁細胞簇之間的區(qū)別標(biāo)志物。

4   在成年人的大腦中表達了CAR-T細胞識別的CD19亞型

接下來，分析成人大腦中CD19的表達，以補充先前通過免疫組織化學(xué)觀察到的結(jié)果。相對于神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)種群，由于組織獲取困難且大腦中神經(jīng)血管細胞數(shù)量少，因此對成年人類大腦樣本中的壁細胞進行scRNA-seq分析具有挑戰(zhàn)性。此外，大多數(shù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)集都針對感興趣的神經(jīng)元群體進行了前瞻性豐富。因此，要詢問成人樣本中是否還存在腦壁細胞中的CD19表達，利用了艾倫研究所Brainspan項目生成的跨人類年齡和大腦區(qū)域的大量RNA-seq數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)包含來自不同大腦區(qū)域的500多個產(chǎn)前和產(chǎn)后樣本。由于在不同樣本中分析的大塊組織將具有不同比例的腦壁/血管細胞，因此整個樣本中腦壁基因的相對表達可替代大塊組織中腦壁細胞的潛在比例。

首先確認CD19在產(chǎn)前和產(chǎn)后樣品中均以相似的水平表達，并且也在不同大腦區(qū)域的樣品中表達（圖6A）。接下來，僅對產(chǎn)后樣品進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，以鑒定與CD19共表達的基因。令人驚訝的是，該分析表明，在這些數(shù)據(jù)中，CD248，CSPG4，ANPEP，F(xiàn)OXS1和FN1位于與CD19相關(guān)的基因的前1％（圖6B和6C）。此外，與CD19最相關(guān)的前200個基因與NVU相關(guān)的基因富集分析中也有豐富的表達，例如血管生成，血管生成，對體剪切應(yīng)力的反應(yīng)以及多個細胞外基質(zhì)相關(guān)術(shù)語（圖6D）。這表明成年大腦中CD19的表達主要是腦壁細胞豐富而不是B細胞豐富的結(jié)果。然后，將來自人腦和外周血單核細胞（PBMC）的scRNA-seq數(shù)據(jù)整合到成人大腦中的CD19相關(guān)基因模塊中（STAR方法）。除其他腦細胞和PBMC之外，這還允許比較腦壁細胞，內(nèi)皮細胞和B細胞中的基因模塊評分。作為對照，與CD22和CD74相關(guān)的基因模塊是兩個高度表達的B細胞富集基因，在B細胞中富集，而CSPG4基因模塊在壁細胞中高度富集（圖6E，）。相反，CD19相關(guān)基因模塊的表達在腦壁細胞中最高（圖6E）。注意到CD19的表達似乎隨著年齡的增長而降低（圖6A）。這可以用兩種可能的機制來解釋：（1）CD19 ⁺細胞的比例隨時間變化，或（2）腦壁細胞中CD19表達水平隨時間變化。最后，探究在成年大腦中表達的CD19亞型是否包含臨床CAR-T細胞和BiTE識別的特定CD19表位。對成年人類大腦中每個CD19外顯子的平均表達的分析表明，各外顯子之間的表達均勻分布，這清楚了關(guān)鍵外顯子2和4的表達（圖6F）。

5   CD19 CAR-T細胞治療小鼠模型的神經(jīng)毒性分析

接下來，詢問在小鼠中人腦壁細胞中CD19的表達是否保守，這將允許使用小鼠模型來研究人神經(jīng)毒性的機制。首先，按照先前描述的方案從健康的C57BL / 6J小鼠中提取并分離了全腦，并通過流式細胞儀分析了CD19的存在。這揭示了CD45高CD19⁺ B細胞群體的存在，正如預(yù)期的那樣，還揭示了CD45^-CD19 ⁺細胞的罕見群體，其表達CD19的水平與B細胞相似，但不表達B細胞標(biāo)記物B220。與人類數(shù)據(jù)中觀察到的相反，被鑒定為CD13⁺CD45的腦壁細胞確實對CD19呈陽性，盡管很少見。為了在轉(zhuǎn)錄水平上檢查這一點，對分離的整個小鼠腦中分離的細胞進行了scRNA-seq測序，然后富集CD19⁺，CD13⁺和CD31⁺細胞。這項分析再次證實，與人腦壁細胞的scRNA-seq相比，腦壁細胞中CD19的表達相對于CD19⁺ B細胞低，并且細胞較少?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，與人腦相比，小鼠腦中CD19 ⁺腦壁細胞相對較少。

鑒于小鼠中存在非B CD19 ⁺細胞，詢問是否將CD19定向的CAR-T細胞輸注到免疫缺陷，無腫瘤的NSG小鼠中是否會導(dǎo)致可觀察到的神經(jīng)系統(tǒng)疾病表型。由于NSG小鼠不發(fā)育B細胞，因此在該模型中觀察到的任何表型都是B細胞獨立的，不能歸因于B細胞靶向后與CRS相關(guān)的整體效應(yīng)。生成了基于CD28或基于4-1BB的CAR-T細胞，它們在信號傳導(dǎo)域上有所不同，但都在臨床上使用，靶向人或小鼠CD19。

輸注CAR-T細胞7天后，NSG小鼠接受了靶向鼠CD19的CAR-T細胞，但那些接受了靶向人CD19的CAR-T細胞的小鼠卻沒有表現(xiàn)出BBB通透性的提高。EBD與白蛋白結(jié)合，白蛋白通常在生理條件下保留在血液中；當(dāng)血腦屏障被破壞時，白蛋白能夠進入腦實質(zhì)。第四組未接受輸血的小鼠未顯示EBD染色，第五組在接受EBD時接受了甘露醇的代表陽性對照的小鼠表現(xiàn)出較高的EBD染色，如圖所示。與mCD19BBz CAR-T細胞組相比，mCD1928z的作用更高，這可能是CD28域提供的更強抗原受體信號傳導(dǎo)的結(jié)果（Salter等人，2018）。確實，先前的研究表明，共刺激結(jié)構(gòu)域的選擇強烈影響基于CD28的CAR對抗原密度的敏感性，特別是對低水平的抗原密度敏感。使用同基因的，具有免疫能力的C57B1 / 7J模型重復(fù)該實驗，并用環(huán)磷酰胺作為淋巴結(jié)消減預(yù)處理方案進行預(yù)處理。同源研究總結(jié)了在NSG模型中觀察到的BBB通透性模式，表明同源模型中鼠CD19⁺B細胞的存在并不影響僅在靶向鼠的條件下觀察到的BBB特異性破壞（圖6E）。最后，從接受治療的小鼠中分離了大腦，并進行了流式細胞術(shù)以測量CAR輸注后CD19⁺腦壁細胞的消耗。接受mCD1928z而非hCD1928z的小鼠顯示CD45⁺CD19⁺B細胞以及CD45^–CD13⁺CD19⁺腦壁細胞均減少。

總之，這些實驗表明，盡管與人腦壁細胞相比，小鼠腦壁細胞中CD19表達的頻率較低，但對CD19定向的CAR-T細胞的施用仍可在缺乏B細胞的小鼠中引起B(yǎng)BB滲漏和腦壁細胞耗竭。可能通過靶向小膠質(zhì)細胞或尚未鑒定的其他表達CD19的細胞類型來介導(dǎo)某些這種作用。這些實驗表明，盡管可以在臨床前小鼠模型中測量CAR-T功能和毒性的某些方面，但存在重要的局限性，因為細胞類型和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的物種特異性差異可能無法完美匹配人類特異性病理生理。實際上，最初在小鼠模型中進行的CAR-T細胞研究并未預(yù)測后來在人類臨床試驗中觀察到的神經(jīng)毒性程度。

6   腦特異性表達CD19

由于壁細胞存在于多個器官中，對來自肺的壁細胞和血管平滑肌細胞進行了腦壁細胞的比較分析，肺是高度血管化的組織，壁細胞和內(nèi)皮細胞數(shù)量很高。盡管所有壁細胞群都顯示出核心轉(zhuǎn)錄同一性的共享表達，例如PDGFRB，RGS5，F(xiàn)OXS1和KCNJ8，但發(fā)現(xiàn)了大腦和肺壁細胞之間的許多轉(zhuǎn)錄差異（圖7A）。值得注意的是，CD19在腦壁而非肺壁細胞中特異性表達。兩種細胞類型在譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子上的廣泛差異可以解釋這種器官特異性。

最后，探究是否相對于肺壁細胞和B細胞而言，預(yù)測位于膜或細胞表面的基因是否在NVU中差異表達，并且可用于提高CD19定向CAR-T的安全性（圖7B和7C）。在腦與肺壁細胞以及B細胞與腦壁細胞和內(nèi)皮細胞中鑒定出被注釋為分泌或位于細胞表面的那些中最高的差異表達。這些可以通過要求兩種抗原的雙重識別來提高針對B細胞的CAR-T細胞的特異性。這項分析揭示了額外的基因，例如CD74，HLA-DRA和LTP，它們相對于腦壁細胞在B細胞上都高度表達并高度富集（圖7C）。提高CAR-T細胞特異性的另一種方法是使用“ NOT”門，其中抑制性CAR構(gòu)建體識別非特異性靶蛋白并阻止T細胞活化。

本研究描述了CD19 CAR-T細胞介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的可能的靶標(biāo)機制，這可能是由于CD19在人腦壁細胞中先前未被識別的表達所引起。研究顯示CD19表達存在于多個獨立的數(shù)據(jù)集中，并存在于壁細胞和血管平滑肌細胞中。這一發(fā)現(xiàn)將為將來在人類樣本中的研究提供參考，包括對患有神經(jīng)毒性的患者的研究。這項研究將著重開發(fā)用于臨床醫(yī)學(xué)的綜合人類單細胞圖譜的眾多實用工具之一。

1  科研│PNAS：高分辨率小鼠腦室下區(qū)干細胞微環(huán)境轉(zhuǎn)錄組揭示了譜系、解剖和衰老的特征

不來關(guān)注一波嘛

END