原名：Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN  

譯名：環(huán)狀RNA circSLC8A1海綿miR-130b/miR-494通過調(diào)節(jié)PTEN抑制膀胱癌進(jìn)展

期刊：Molecular Cancer

IF：10.67（2018影響因子）

發(fā)表時(shí)間：2019年

通訊作者：郭宏騫

通訊作者單位：南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

DOI號：10.1186/s12943-019-1040-0

從RNA測序數(shù)據(jù)中鑒定出差異表達(dá)的circRNA，并將circSLC8A1確定為一個(gè)新的候選circRNA。qRT-PCR法檢測circRNAs、miRNAs和mRNAs在人體組織和細(xì)胞中的表達(dá)。采用RNA下拉實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)研究特異性circRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用。體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，觀察circSLC8A1對膀胱癌細(xì)胞的作用。Western blot檢測PTEN的表達(dá)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測其生物學(xué)作用。

1. CircSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中的表達(dá)顯著下調(diào)

CircSLC8A1起源于SLC8A1基因，由外顯子1(1832bp)的頭尾拼接組成 (圖 1a)。為探討circSLC8A1在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，研究人員檢測了70對膀胱癌組織和正常膀胱組織中circSLC8A1的表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)circSLC8A1在膀胱癌組織中明顯低表達(dá) (圖 1b)。值得注意的是，對膀胱癌腫瘤樣本的配對分析顯示，在所有患者樣本中，circSLC8A1的表達(dá)減少的標(biāo)本數(shù)超過80% (圖 1c)。相關(guān)分析顯示，circSLC8A1的表達(dá)與臨床病理特征(包括病理分期和組織學(xué)分級)相關(guān)(表 1)。此外，circSLC8A1在6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系(5637、T24、J82、EJ、UMUC和RT4)中的表達(dá)低于正常尿路上皮細(xì)胞系SV-HUC-1 (圖 1d)。接下來，研究設(shè)計(jì)了聚斂引物來擴(kuò)增SLC8A1 mRNA，發(fā)散性引物來擴(kuò)增circSLC8A1。以5637和T24細(xì)胞的cDNA和gDNA(基因組DNA)為模板，circSLC8A1在cDNA中只被發(fā)散性引物擴(kuò)增，而在gDNA中沒有觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖 1e)。通過qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)circSLC8A1對RNase R具有抗性，而RNase R處理后的SLC8A1 mRNA顯著減少(圖 1f)。

圖 1 CircSLC8A1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)。a SLC8A1外顯子1形成環(huán)狀SLC8A1的示意圖。RT-PCR證實(shí)了circSLC8A1的存在，Sanger測序證實(shí)了circSLC8A1的后剪接。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊拼接位點(diǎn)。b和c采用不同引物的qRT-PCR檢測證實(shí)，70對人膀胱癌組織中circSLC8A1的表達(dá)水平均低于癌旁正常組織。d 用qRT-PCR檢測circSLC8A1在SV-Huc-1和膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)。e RT-PCR證實(shí)在5637和T24細(xì)胞系中存在circSLC8A1。發(fā)散性引物可在cDNA中擴(kuò)增circSLC8A1，但在基因組DNA(gDNA)則不能。f 采用qRT-PCR方法檢測RNase R處理前后5637和T24細(xì)胞中CircSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達(dá)。

2. 過表達(dá)circSLC8A1抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲

鑒于本研究中circSLC8A1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，研究人員將circSLC8A1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞，并顯著上調(diào)了circSLC8A1的表達(dá)(圖 2a)。同時(shí)，SLC8A1 mRNA的表達(dá)無明顯變化(圖 2a)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，circSLC8A1的過表達(dá)顯著抑制了5637和T24細(xì)胞的遷移(圖 2b)。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)一致表明，circSLC8A1的過表達(dá)也抑制了膀胱癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。(圖 2c和2d)。將針對circSLC8A1連接位點(diǎn)的siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞。這些siRNA顯著降低了circSLC8A1的表達(dá)，但對SLC8A1 mRNA沒有影響(圖 2e)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell分析表明，敲除circSLC8A1顯著增加了5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力 (圖2f-h)。

圖 2 CircSLC8A1過表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲。a qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ蛰d體質(zhì)粒后5637和T24細(xì)胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達(dá)水平。b 通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察circSLC8A1對5637和T24細(xì)胞遷移能力的影響。c and d  通過遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染circSLC8A1和對照載體的5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力。e將兩個(gè)針對circSLC8A1的siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞。采用qRT-PCR檢測各siRNA對circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效果。f 通過劃痕實(shí)驗(yàn)，分別觀察了circSLC8A1-1對5637和T24細(xì)胞遷移能力的影響，并用流式細(xì)胞儀檢測了sIcSLC8A1-1對細(xì)胞遷移能力的影響。g and h 用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染si circSLC8A1-1或siNC的5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3. circSLC8A1在膀胱癌細(xì)胞中作為miR-130b和miR-494的海綿

生物素標(biāo)記的探針在5637、T24和SV-HUC-1細(xì)胞系中被證實(shí)能下拉circSLC8A1(圖 3a和b)。檢測了7個(gè)候選miRNAs的水平，結(jié)果表明在5637和T24細(xì)胞中miR-130b和miR-494是僅有的兩個(gè)miRNAs能被circSLC8A1充分下拉(圖 3c、d和e)。生物素標(biāo)記的miR-130b/miR-494比生物素標(biāo)記的陰性對照捕獲了更多的circSLC8A1(圖 3f和g)。此外，RNA FISH實(shí)驗(yàn)表明，circSLC8A1和miR-130b/miR-494共定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3h和i)。

圖 3 CircSLC8A1在膀胱癌細(xì)胞中作為miR-130b和miR-494的海綿。a and b 將5637、T24和SV-HUC-1裂解產(chǎn)物中的circSLC8A1拉下，用circSLC8A1特異性探針富集，然后用qRT-PCR進(jìn)行檢測。C, d and e 用qRT-PCR檢測5637、T24和SV-HUC-1裂解產(chǎn)物中7個(gè)候選miRNA的相對水平。在5637和T24細(xì)胞系中，circSLC8A1探針可以拖拽多個(gè)miRNA，并且miR-130b和miR-494都可以被circSLC8A1探針拖拽。f and g 將生物素標(biāo)記的miR-130b或miR-494轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞。鏈霉親和素捕獲后，用qRT-PCR定量檢測circSLC8A1的水平。h and i RNA FISH實(shí)驗(yàn)檢測T24中circSLC8A1和miR-130b/miR-494的共定位情況。細(xì)胞核染成藍(lán)色(DAPI)，circSLC8A1染成紅色，miR-130b/miR-494染成綠色。

4. miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展

qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中miR-130b和miR-494表達(dá)上調(diào)(圖 4a和b，表2)。相關(guān)分析顯示，circSLC8A1的表達(dá)與miR-130b或miR-494呈負(fù)相關(guān)(圖 4c和d)。過表達(dá)miR-130b和miR-494顯著促進(jìn)了5737和T24細(xì)胞的增殖(圖 4e和f)。Transwell分析表明，miR-130b或miR-494的過表達(dá)顯著促進(jìn)了5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲(圖 4g和h)。相反，轉(zhuǎn)染miR-130b/miR-494抑制劑明顯抑制5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲(圖 4i和j)。根據(jù)TargetScan (http://www./) 和Miranda預(yù)測，研究者發(fā)現(xiàn)miR-130b和miR-494都能與PTEN的3’-UTR區(qū)域結(jié)合(圖 4k)。接下來，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告分析來驗(yàn)證這種相互作用。結(jié)果表明，與模擬物NC相比，轉(zhuǎn)染miR-130b或miR-494模擬物可顯著降低攜帶野生型PTEN 3’-UTR的熒光素酶報(bào)告基因的活性。相反，突變的熒光素酶報(bào)告不受miR-130b或miR-494過表達(dá)的影響(圖 4l)。Western blot分析表明，miR-130b或miR-494模擬物可以抑制PTEN的表達(dá)(圖 4m)。

圖 4 miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。a and b qRT-PCR結(jié)果顯示，30例膀胱癌組織中miR-130b和miR494的表達(dá)均高于癌旁正常組織。c and d 皮爾遜相關(guān)分析提示circSLC8A1的表達(dá)與miR-130b/miR-494呈負(fù)相關(guān)。e and f CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示miR-130b和miR-494對5637和T24細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。g and h 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染miR-130b或miR-494模擬物的5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。i and j 轉(zhuǎn)染抗miR-130b或抗miR-494可抑制5637和T24細(xì)胞的遷移和侵襲。k 生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-130b/miR-494結(jié)合位點(diǎn)在PTEN mRNA 3’-UTR中。l 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-130b/miR-494與PTEN mRNA的相互作用。m miR-130b和miR-494分別降低PTEN蛋白表達(dá)水平。

5. CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)并抑制膀胱癌進(jìn)展

CircSLC8A1的過表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力受到抑制，但這種作用可以被miR-130b或miR494的異位表達(dá)部分減弱(圖 5a，b和c)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染circSLC8A1質(zhì)粒的細(xì)胞相比(圖 5d和e)，共同轉(zhuǎn)染circSLC8A1質(zhì)粒和miR-130b/miR-494模擬物的膀胱癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)明顯降低，這與細(xì)胞功能的結(jié)果一致。此外，膀胱癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(圖 5f)。上述結(jié)果表明，circSLC8A1通過海綿miR-130b/miR-494和調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)來抑制膀胱癌的進(jìn)展。

圖 5 CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，抑制膀胱癌的進(jìn)展。a, b and c Transwell侵襲和CCK-8檢測顯示，CircSLC8A1抑制5637和T24細(xì)胞的侵襲和增殖，當(dāng)與miR-130b或miR-494共轉(zhuǎn)染時(shí)，抑制作用被逆轉(zhuǎn)。d and e Western blot結(jié)果顯示，miR-130b和miR-494可部分降低circSLC8A1促進(jìn)的PTEN蛋白表達(dá)水平。f 10對人膀胱癌組織及癌旁正常組織中PTEN蛋白的Western blot分析。

6. CircSLC8A1體內(nèi)抑制膀胱癌腫瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究

裸鼠皮下注射癌細(xì)胞后每周測量腫瘤體積。與對照組相比，circSLC8A1過表達(dá)組的生長速度和腫瘤重量顯著降低(圖 6c和d)。在circSLC8A1過表達(dá)組中，circSLC8A1表達(dá)水平上調(diào)，然而根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，miR-130b和miR-494水平下調(diào)(圖 6e)。IHC分析表明，通過過度表達(dá)circSLC8A1(圖 6f)，PTEN在腫瘤中的表達(dá)增加。這些結(jié)果表明，circSLC8A1過表達(dá)能有效地抑制膀胱癌的體內(nèi)生長。

圖 6 CircSLC8A1在體內(nèi)對膀胱癌腫瘤的生長有抑制作用。a 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ蛰d體的T24細(xì)胞皮下注射至裸鼠皮下，建立皮下移植瘤(n=6)。b 裸鼠異種移植瘤形成示意圖。c and d 與空白載體組相比，circSLC8A1處理組裸鼠的腫瘤生長率和重量均顯著降低。e采用qRT-PCR方法檢測腫瘤組織中circSLC8A1、miR-130b和miR-494的表達(dá)水平。f 免疫組化染色檢測移植瘤中PTEN、AKT、p-AKT和MMP9的表達(dá)。

綜上所述，研究結(jié)果表明，circSLC8A1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并且它能夠作為miR-130b和miR-494的海綿來調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)。此外，還證明了通過靶向miR-130b、miR-494/PTEN軸，circSLC8A1的過表達(dá)可以有效地抑制膀胱癌的進(jìn)展。研究結(jié)果不僅解釋了circRNA調(diào)控膀胱癌細(xì)胞生長的機(jī)制，而且為膀胱癌的治療提供了一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。