摘要

• 呼吸道微生物組學(xué)的研究明顯少于腸道微生物組學(xué)。盡管在呼吸機相關(guān)性肺炎（VAP）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）中呼吸道菌群失調(diào)具有重要意義，但重癥監(jiān)護(hù)室機械通氣患者中氣道菌群的研究卻很少。部分研究發(fā)現(xiàn)下呼吸道和口咽道的細(xì)菌種群之間存在交叉重疊；且菌群相對豐富的細(xì)菌難以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

• 在機械通氣條件下，呼吸道微生物多樣性隨著通氣時間延長而降低。在VAP發(fā)生過程中，呼吸道微生物生態(tài)失調(diào)，其特征是菌群向占主導(dǎo)地位的細(xì)菌病原體轉(zhuǎn)移（主要是變形桿菌），而腸道相關(guān)細(xì)菌的富集（主要是腸桿菌科）是區(qū)分ARDS患者的典型特征。但這種生態(tài)失調(diào)在VAP和ARDS發(fā)病機制中的作用尚不明確。

• 對細(xì)菌、病毒和真菌之間相互作用的深入分析以及對宿主-微生物相互作用的深入理解，可以更全面的了解微生物組學(xué)在VAP和ARDS發(fā)病機制中的作用。

• 本文就關(guān)于機械通氣患者呼吸道微生物研究的現(xiàn)狀、應(yīng)用前景以及潛在臨床應(yīng)用價值作描述性綜述。

介紹

• 由于傳統(tǒng)檢測方法較差的敏感性，一直認(rèn)為肺是無菌的。但是隨著非傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，特別是高通量測序，這一理念受到挑戰(zhàn)。許多微生物包括細(xì)菌、病毒和真菌，共存于健康人的肺中，構(gòu)成呼吸道微生物群。即使目前使用了16S rRNA基因測序技術(shù)，但對肺部微生物群的研究還局限于單一的細(xì)菌微生物群階段。

• 同慢性呼吸系統(tǒng)疾病相比，在重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究尚處于起步階段，但是同腸道菌群失調(diào)一樣，呼吸道微生物群與宿主的相互作用以及失調(diào)也極有可能在慢性炎癥性疾?。ㄈ缦?、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和囊性纖維化疾病的病理生理學(xué)機制中起關(guān)鍵作用。

• 此外，目前并沒有研究關(guān)注機械通氣患者真菌菌群或病毒組方面的演變規(guī)律，而肺中真菌定植和病毒復(fù)制在這一人群中廣泛存在。因此，闡釋全肺微生物組學(xué)（包括細(xì)菌、真菌和病毒）的動態(tài)演變是呼吸學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一，以重新定義我們對呼吸機相關(guān)肺炎（VAP）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）病理生理機制的理解。

• 本綜述的目的是明確微生物組學(xué)研究中使用的主要定義和術(shù)語，介紹重癥醫(yī)學(xué)中呼吸道微生物組學(xué)的最新知識，并介紹目前使用的技術(shù)及各自局限性。并通過對呼吸道微生物組學(xué)以及其演變規(guī)律更深入的理解，為未來更多的研究項目奠定基礎(chǔ)，以更好的對急性肺損傷進(jìn)行預(yù)防、診斷和治療，特別是ARDS和VAP。

肺細(xì)菌組群

• 細(xì)菌微生物組群代表培養(yǎng)基中所有細(xì)菌成分。從域到種分類的細(xì)菌分類學(xué)用于描述細(xì)菌微生物群（圖1以銅綠假單胞菌為例）。

• 人的肺部微生物組群可以利用下呼吸道分泌物樣本進(jìn)行研究。最近的研究表明，健康人口咽部和下呼吸道的微生物組群組成相似，而所有慢性呼系統(tǒng)疾?。–OPD和間質(zhì)性肺疾病，如特發(fā)性肺纖維化）的上、下呼吸道的微生物群組組成卻不同；目前暫沒有急性肺炎患者口咽和肺部微生物組群的公開報道數(shù)據(jù)。

• 在重癥醫(yī)學(xué)科，支氣管肺泡灌洗（BAL）比氣管內(nèi)抽吸（ETA）收集下呼吸道分泌物更為常用。然而，據(jù)我們所知，沒有研究比較這兩種取樣方法的優(yōu)劣。因此，無法給出優(yōu)先選擇的明確建議。

• 下呼吸道微生物群的主要特點是密度低，根據(jù)傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法的評估，每毫升約有10⁵個菌落單位形成。這相當(dāng)于每克組織中10⁵個細(xì)菌的生物量。盡管密度很低，但卻觀察到很高的多樣性，這構(gòu)成了呼吸道健康的生物標(biāo)志物。在這種多樣性中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)健康個體中存在的一組細(xì)菌物種，代表肺部的“核心微生物群”。這種核心微生物群主要由普氏菌屬、鏈球菌屬、維氏菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬組成。

• 對于單個體而言，肺部微生物群的組成均來源于這個核心微生物群，是上呼吸道微生物擴(kuò)散和宿主防御消除微生物之間平衡的結(jié)果。同腸道微生物群一樣，肺部微生物群的組成可能是由許多內(nèi)源性因素共同形成的，比如粘液產(chǎn)生和固有免疫機制，但也有外源性因素，如環(huán)境多樣性。

• 與細(xì)菌微生物群一樣，真菌微生物群代表了一個生態(tài)系統(tǒng)或其樣本中的所有真菌物種。真菌基因組在真菌界中也包含高度保守的序列，這些序列框定了高變區(qū)，允許對其進(jìn)行鑒定。
  
  

• 人類病毒組對應(yīng)于培養(yǎng)基中所有DNA和RNA病毒的基因組。它包括兩大實體：真核病毒和原核病毒（噬菌體）。與細(xì)菌和真菌不同的是，人類病毒界沒有保存基因組序列，只有病毒組可以研究，這就需要對樣本中的所有核酸序列進(jìn)行深度測序，以分析病毒組群。

• 在高通量測序領(lǐng)域取得的進(jìn)展使人們能夠在不依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的情況下，深入研究生物多樣性和生物多樣性。規(guī)定了明確了解這一專業(yè)領(lǐng)域所需的定義。呼吸道微生物組群分析方法的一般原則，包括微生物組、真菌組和病毒組見圖2；其局限性見在線補充材料。

• 圖3示：隨時間推進(jìn)的實例說明微生物演變α和β多樣性概念。

重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）肺部細(xì)菌菌群

肺部微生物群與機械通氣

1. 迄今為止，大多數(shù)關(guān)于呼吸道微生物群的研究都是在哮喘、慢性阻塞性肺病和囊性纖維化等慢性呼吸系統(tǒng)疾病患者中進(jìn)行的。研究似乎表明：（1）每種慢性呼吸系統(tǒng)疾病都與不同的微生物群特征有關(guān)；（2）菌群失調(diào)的嚴(yán)重程度與臨床狀況之間存在關(guān)聯(lián)性。只有少數(shù)描述性研究在重癥監(jiān)護(hù)病房進(jìn)行，其中一項從機械通氣并且明確銅綠假單胞菌定植的患者中收集微生物的研究表明，ETA中的微生物種群極其多樣。

2. Bousbia等人還觀察到，在機械通通氣中的社區(qū)獲得性肺炎（CAP）或VAP患者中， 收集的BAL標(biāo)本中存在重要的細(xì)菌多樣性。共鑒定出7門146種細(xì)菌，其中73種從未在肺炎患者中被描述過。隨后，Smith等人特別關(guān)注了15名未感染的機械通氣患者的肺微生物群，這些患者通過傳統(tǒng)微生物檢測方法測定BAL陰性。共鑒定出3個菌門，主要為厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門。大多數(shù)患者具有高度的α多樣性（給定個體樣本中的物種多樣性）。個體間變異主要是在屬水平上描述的。然而，在機械通氣過程中氣道微生物群的動態(tài)演化問題，這可能是最相關(guān)的研究，剛剛在最近的兩個研究中得到解決。

3. 2016年，Kelly等人報告，與對照組（健康、未通氣受試者）相比，插管后α多樣性迅速下降，隨著機械通氣時間的延長，α多樣性逐漸下降。與對照組相比，機械通氣患者的微生物群分布也顯示出更多的個體差異（β多樣性更高）。這主要是由于單一操作分類單位（OTU）在機械通氣患者中占主導(dǎo)地位。同樣觀察35名機械通氣患者，對111份樣本進(jìn)行了分析。在這個人群中，α多樣性隨著機械通氣時間的延長而減少，有趣的是，抗生素對氣道微生物群的演變沒有影響。但是最近Emonet等人缺未能觀察到VAP患者與對照組相比在兩個時間點（插管當(dāng)天和后續(xù)標(biāo)本）之間個體差異的顯著變化。

1. 除了機械通氣對肺部微生物群的特殊影響外，ARDS或嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）可直接或通過腸道微生物群的富集對其成分產(chǎn)生影響。只有少數(shù)臨床前研究對危重患者的這些方面進(jìn)行了研究，但腸道和肺部微生物組群之間的關(guān)系在哮喘或囊性纖維化疾病中得到了良好的描述，被稱為“腸-肺”軸。

2. 在小鼠敗血癥模型中，Dickson等人報告了腸道細(xì)菌在肺部微生物群中的富集，包括類桿菌目、腸球菌種和毛螺菌種。研究認(rèn)為“在實驗性膿毒癥后，肺部微生物群發(fā)生改變，至少5天內(nèi)保持改變，2周后恢復(fù)正常”。在68例ARDS患者的BAL樣本中，33%的病例出現(xiàn)類桿菌，而健康對照組只有3%。同一作者在最近對91例機械通氣患者的研究中發(fā)現(xiàn)，肺部微生物群中的腸道相關(guān)細(xì)菌與ARDS的發(fā)生有關(guān)。因此，他們提出了腸道微生物組群在這兩種常見危重疾病中所起的潛在尚未確定的共同機制。另外兩項研究表明，與對照組相比，ARDS患者的α多樣性降低。然而，ARDS患者肺部微生物群的高度異質(zhì)性不允許特定的個體化。

3. 總而言之，目前仍需可對比的方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以更好地描述不同因素在微生物生態(tài)失調(diào)、炎癥和肺損傷的惡性循環(huán)中的作用，并確定腸道細(xì)菌富集對肺微生物群的真實作用和影響。

1. 在急性肺部感染，尤其是在機械通氣患者中，肺部細(xì)菌微生物群很少受到關(guān)注。2007年，F(xiàn)lanagan等首次對已明確呼吸道定植銅綠假單胞菌的機械通氣患者ETA中的16S rRNA基因進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)最常見的細(xì)菌屬于三個主要門：厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門，與口咽、鼻和胃腸道的菌群中其他數(shù)量較少的菌種（如乳酸桿菌、腸球菌和靜脈內(nèi)耳菌）有關(guān)?？股刂委熍c微生物群多樣性和銅綠假單胞菌占優(yōu)勢有關(guān)。因為本研究選擇的對象是定植菌患者，所以口咽和消化道微生物群可能是定植細(xì)菌的來源，這些細(xì)菌在機械通氣期間會引起微生物生態(tài)失調(diào)。

2. Zakharkina等人比較了機械通氣患者呼吸道微生物群的演變，無論他們是否發(fā)生VAP。與未發(fā)生VAP的機械通氣患者相比，發(fā)生VAP的患者中細(xì)菌群的更大異質(zhì)性解釋了其β多樣性顯著增加的原因。似乎可以產(chǎn)生一個概念，VAP的責(zé)任細(xì)菌代表了主要的OUT（本研究中主要指金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌和假單胞菌屬）將減少其他細(xì)菌菌落數(shù)。根據(jù)這些研究的結(jié)果，我們還可以假設(shè)一些非致病性菌種對VAP的發(fā)生具有保護(hù)性屏障作用。

3. 呼吸道微生物群風(fēng)險標(biāo)志物的識別可能是更需要關(guān)注的問題。Emonet等嘗試在插管期間早期鑒別VAP的亞分類標(biāo)記物，他們發(fā)現(xiàn)VAP患者和對照組患者在任何時間點的ETA樣本中微生物群都沒有顯著變化。然而，VAP患者的ETA在VAP前3天含有較多的丙種變形桿菌類（假單胞菌屬，腸桿菌科），而在經(jīng)口氣管插管后含有較少的桿菌類（腸球菌屬，鏈球菌屬，乳酸桿菌屬和葡萄球菌屬）。作者試圖利用這一差異對VAP組和對照組的患者進(jìn)行分類，但他們的結(jié)果尚未得到證實。

肺真菌區(qū)系

1. 最近有一些研究利用高通量測序來評估肺真菌生物群。對健康人肺真菌群的研究發(fā)現(xiàn)，許多環(huán)境真菌包括曲霉屬、霉菌（青霉屬和枝孢屬）和酵母菌，屬于兩個主要的子囊菌門（念珠菌門）和擔(dān)子菌門（馬拉色菌門）。真菌菌群失調(diào)及其與肺部疾病的相關(guān)性研究尚處于起步階段。

2. 在大多數(shù)培養(yǎng)基中，細(xì)菌和真菌群落之間存在著相互作用，其中一個菌群的演變會導(dǎo)致另一個菌落的改變。機械通氣患者中，在數(shù)日機械通氣后，一些酵母菌，特別是氣道定植的念珠菌屬，在25%到50%的患者中可以發(fā)現(xiàn)。這種定植與細(xì)菌性肺部感染的發(fā)生有關(guān)。因此，即使真菌、細(xì)菌和宿主之間相互作用的確切機制仍不清楚，細(xì)菌與真菌的相互作用在VAP的發(fā)病機制中仍起著重要作用。在一項為期4年的危重病患者多中心研究中，214例（26%）呼吸道定植患者與214例未暴露患者進(jìn)行匹配和比較。支氣管念珠菌定植是假單胞菌肺炎的獨立危險因素（9 vs 4,8%），校正比值比（aOR）=2.22[1,00；4,92]（p=0.049），但對死亡率無影響。一種可能機制是白念珠菌引起的細(xì)菌吞噬功能的改變。

3. Roux等人在大鼠中發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌氣道定植引起Th1-Th17免疫反應(yīng)，通過抑制肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬作用促進(jìn)細(xì)菌性肺炎的發(fā)展。他們還表明，在體外，白色念珠菌阻礙肺泡巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，并在體內(nèi)與大鼠銅綠假單胞菌肺炎發(fā)病率的增加相關(guān)。Tan等人表明，同樣的白色念珠菌定植有利于大鼠鮑曼不動桿菌肺炎。同一研究小組還發(fā)現(xiàn)，在機械通氣的ICU患者中，念珠菌氣道定植是鮑曼不動桿菌VAP的獨立危險因素。

4. 目前只有兩項研究專門針對ICU中真菌性肺炎的。Bousbia等人在對31名肺炎患者和6名對照者進(jìn)行的開創(chuàng)性研究中，確定了22種真菌，屬于2個門：子囊菌門和擔(dān)子菌門。未觀察到真菌生物群與細(xì)菌種類之間的特殊聯(lián)系。在Krause等人關(guān)于重癥監(jiān)護(hù)病房患者的真菌生物群的研究中，觀察到每一個有肺炎的機械通氣患者的真菌多樣性下降。假絲酵母菌多見于肺部真菌區(qū)系，占真菌種類的75%。
   

病毒組

1. 病毒是最豐富和多樣的實體，病毒組包括真核病毒（真核病毒組）和噬菌體（原核病毒組）。真核病毒感染人類宿主的細(xì)胞。它們可能是致病的，引起急性或慢性感染。它們也可以在病理狀態(tài)（巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒）下重新激活，并且可以在沒有任何病理的情況下持續(xù)存在。它們與免疫系統(tǒng)的相互作用似乎在呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)展中起著重要作用，盡管沒有因果關(guān)系可以明確。第二類：噬菌體，感染細(xì)菌細(xì)胞。它們代表了在人類呼吸道中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)病毒。

2. 整合病毒組的所有成分以獲得對人類微生物組的全面了解似乎是必要的。

1. 機械通氣對呼吸道病毒組的影響尚不清楚。皰疹病毒科、副粘病毒科和小核糖核酸科的病毒在所有機械通氣的ICU患者周中都已被明確。在重癥監(jiān)護(hù)病房患者中，由于病毒的重新激活，人類病毒組發(fā)生了較大的改變，特別是在皰疹組。感染EBV（14.6%）、HSV 1型（33-68.3%）和CMV（17%）的膿毒癥患者呼吸道中的病毒再激活已被證實。這種病毒組生態(tài)失調(diào)可能與較長的ICU住院時間和死亡率有關(guān)。

2. 在93例懷疑VAP的機械通氣患者中，巨細(xì)胞病毒（CMV）肺部感染（定義為BAL中CMV復(fù)制）與機械通氣持續(xù)時間延長、ICU住院時間延長和死亡率升高相關(guān)，而HSV在肺部復(fù)制與之卻無關(guān)。此外，ICU中CMV再激活患者的細(xì)菌或真菌交叉感染率增加。病毒在VAP發(fā)生中的作用及其對患者預(yù)后的影響取決于病毒本身。這些數(shù)據(jù)大多來自目標(biāo)PCR。

3. 需要進(jìn)行宏基因組研究來全面描述ICU機械通氣期間肺病毒組的演變，并確定病毒生態(tài)失調(diào)在患者預(yù)后和VAP發(fā)展中的作用和機制。

臨床應(yīng)用 

1. 雖然采樣和數(shù)據(jù)處理的效率正在提高，但微生物組分析在臨床醫(yī)療決策中的應(yīng)用還沒有完全開展。目前實時測序技術(shù)的發(fā)展可以通過快速準(zhǔn)確的生物種類鑒定影響診斷方法。
2. 捕捉時間動態(tài)和確定微生物豐富性的生態(tài)失調(diào)特征和閾值是區(qū)分氣道定植和VAP的關(guān)鍵。此外，早期發(fā)現(xiàn)VAP高風(fēng)險患者的微生物生態(tài)失調(diào)對改善臨床實踐及患者預(yù)后有很大意義。
3. 早期的靶向VAP抗生素治療，以期在選定的病人中進(jìn)行常規(guī)微生物分析，而不是經(jīng)驗性地使用廣譜抗生素，將是對抗抗生素耐藥性的一個進(jìn)步。比靶向VAP抗生素治療更有意義的是，早期發(fā)現(xiàn)與VAP高風(fēng)險相關(guān)的微生物失調(diào)患者，可以制定更有針對性的預(yù)防策略（在線補充材料詳細(xì)介紹此類研究方法）。
4. ICU領(lǐng)域宏基因組學(xué)縱向分析研究還必須關(guān)注微生物之間的相互作用，以確定與VAP發(fā)生風(fēng)險增加相關(guān)的細(xì)菌、真菌和病毒生物標(biāo)記物。同時關(guān)注宿主反應(yīng)將有助于更好地確定患者的發(fā)病特征。
5. 總的來說，更好地理解病理生理學(xué)知識可以幫助我們確定目標(biāo)細(xì)菌群、真菌群和病毒組（包括原核和真核病毒），以制定針對性的干預(yù)措施。使用益生菌或益生元或?qū)AP高危患者使用預(yù)防性霧化抗生素可能是治療微生物生態(tài)失調(diào)可的一種方法（具體見在線補充資料），除此之外，也可以通過其他方式取得臨床獲益，如抗病毒或噬菌體療法。

1. 所有這些數(shù)據(jù)都強調(diào)了對人類呼吸系統(tǒng)微生物群采取國際標(biāo)準(zhǔn)方法采樣檢測的必要性，不僅包括細(xì)菌菌群，還包括真菌微生物群和病毒組。對單一類型的微生物群的分析可能會導(dǎo)致對微生物群對健康影響的片面看法。在未來，必須首先考慮達(dá)成統(tǒng)一的分析方法，并進(jìn)行縱向研究，以更好地了解VAP的發(fā)病機制。

2. 高通量測序和生物信息分析方法的發(fā)展雖然復(fù)雜且昂貴，但會讓我們更深入的探索全球人類呼吸系統(tǒng)微生物群，以便更好的預(yù)防和治療醫(yī)院獲得性肺炎和ARDS等。
   

1. 真菌、細(xì)菌和病毒（噬菌體和真核病毒）之間的相互作用強調(diào)了同時分析其演變的必要性，以了解VAP的病理生理機制及其在ARDS病程中的作用。
2. 經(jīng)驗證和認(rèn)可的分析方法（提取、擴(kuò)增、測序、生物信息分析）應(yīng)允許微生物組研究的均勻化和研究之間的對比。