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本文由艾奧里亞編譯，董小橙、江舜堯編輯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導 讀 抗生素在世界范圍內(nèi)普遍使用，農(nóng)藥是人類經(jīng)常接觸的一種外來生物?？股貙r(nóng)藥的交互作用鮮有研究。我們的目的是研究抗生素對農(nóng)藥暴露風險的影響，以及抗生素是否改變了腸道微生物區(qū)系對農(nóng)藥生物利用率的影響。此外，我們還探討了腸道微生物菌群影響農(nóng)藥在宿主體內(nèi)命運的機制。結(jié)果：氨芐青霉素或抗生素雞尾酒療法的大鼠顯著增加了口服三嗪類除草劑的生物利用率?？股馗淖兒蟮哪c道微生物群通過下調(diào)肝臟代謝酶基因表達和上調(diào)腸道吸收相關蛋白，直接增加農(nóng)藥生物利用率。結(jié)論：抗生素可以提高農(nóng)藥的生物利用率，從而增加農(nóng)藥暴露的風險?？股赝ㄟ^改變腸道微生物群可以改變肝臟代謝酶基因的表達和腸道吸收相關的蛋白質(zhì)組，是提高生物利用率的一個關鍵原因。這項研究揭示了尚未發(fā)現(xiàn)的抗生素對健康的潛在影響，并提醒人們在服用抗生素時要考慮共同暴露的外來化合物。 論文ID 原名：Antibiotics may increase triazine herbicide exposure risk via disturbing gut microbiota 譯名：抗生素可能通過干擾腸道微生物來增加三嗪類除草劑的暴露風險（國人作品） 期刊：Microbiome IF：9.133 發(fā)表時間：2018 通信作者：Peng Wang，Zhiqiang Zhou 通信作者單位：中國農(nóng)業(yè)大學 實驗設計 根據(jù)人的給藥方案用相同劑量的氨芐青霉素處理大鼠（每天3次灌胃，每次90 mg/kg體重）。氨芐青霉素處理3d后，口服三嗪類除草劑（2 mg/kg體重）。隨后再給大鼠注射氨芐青霉素四天，然后再口服三嗪類除草劑。采用無氨芐青霉素的水作為對照組。三嗪類除草劑處理大鼠后，取其血液樣本對血液中的除草劑含量進行檢測（圖S1）。 圖S1 氨芐青霉素暴露實驗設計。氨芐青霉素每日3次，字母a、b和c分別為8：00、16：00和23：00。分別于第4天和第8天口服三嗪類除草劑（2 mg/kg體重）（n=5）。 實驗結(jié)果 1 氨芐青霉素對三嗪類除草劑生物利用率的影響 通過研究發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素處理組和對照組的血液中除草劑濃度在10分鐘左右達到峰值，表明三嗪類除草劑在大鼠體內(nèi)快速吸收（圖1）。與對照組相比，處理組中的最大血藥濃度顯著高于對照組（P<0.05）。氨芐青霉素處理組處理3天后其不同除草劑（西瑪津，莠滅凈，草克凈，阿特拉津以及特丁津）的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）分別較對照組提高了3.31%，55.6%，29.1%，26.4%以及50.3%。其中，草克凈，阿特拉津以及特丁津在處理組中顯著高于空白組（P<0.05）。在口服7天后可觀察到類似的結(jié)果，進一步表明，氨芐青霉素處理可能會導致三嗪類除草劑生物利用率的增加（圖2）。 圖1 氨芐青霉素處理3d后，大鼠體內(nèi)三嗪類除草劑的血藥濃度。對照組大鼠給予等量的不含氨芐青霉素的水。柱狀圖顯示三嗪類除草劑的AUC，百分比代表氨芐青霉素處理大鼠的AUC增加速率（采用獨立樣本t檢驗，*P<0.05，n=5）。 圖2 氨芐青霉素處理7d后，大鼠體內(nèi)三嗪類除草劑額血藥濃度。對照組大鼠給予等量的不含氨芐青霉素的水。柱狀圖顯示三嗪類除草劑的AUC，百分比代表氨芐青霉素處理大鼠的AUC增加速率(獨立樣本t檢驗，*P<0.05，n=5)。 此外，還對腸道微生物數(shù)量和組成進行了測定，進一步探究了氨芐西林暴露對腸道微生物群落的影響。如圖3所示，氨芐青霉素3天和7天顯著降低了大鼠體內(nèi)細菌數(shù)量（P<0.01）。氨芐青霉素處理3天和7天也會降低Shannon指數(shù)，并導致基于Bray-Curtis距離的主坐標分析（PCoA）的組成有明顯的區(qū)分（圖S2-S3）。如熱圖所示，基于顯著變化的微生物細菌屬，3天和7天氨芐青霉素處理的大鼠的Ruminococcaceae，Lachnospiraceae以及Anaerotruncus等細菌屬的相對多度降低。這些結(jié)果表明，氨芐青霉素處理顯著改變了微生物的多樣性和組成（圖S2c，圖S3c）。 圖3 氨芐青霉素和抗生素組合治療對大鼠盲腸細菌數(shù)量的影響。a，b，c分別代表氨芐青霉素處理3d，7d以及抗生素雞尾酒療法處理14d后盲腸糞便樣本中原核生物16S rRNA基因拷貝數(shù)（獨立樣本t檢驗，*P<0.01，n=5）。 圖S2 氨芐青霉素處理3 d對微生物多樣性和組成的影響(n=5)。A：微生物多樣性Shannon指數(shù)（獨立樣本t檢驗，*P<0.001），B：Bray-Curtis比較的主坐標分析(PCoA)，顯示氨芐青霉素處理與未處理大鼠糞便微生物組成不同；C：根據(jù)氨芐青霉素處理3d后的大鼠與未用氨芐青霉素大鼠相比，微生物種類發(fā)生顯著變化的熱圖（不同顏色的值代表物種的相對多度，獨立樣本t檢驗，P<0.05被認為有顯著性差異）。 圖S3 氨芐青霉素處理7 d對微生物多樣性和組成的影響(n=5)。同圖S2所示。 2 抗生素雞尾酒療法增加了大鼠體內(nèi)三嗪類除草劑生物利用率 通過研究發(fā)現(xiàn)，使用單一抗生素可提高三嗪類除草劑的生物利用率，進一步測定了增加抗生素劑量是否會產(chǎn)生類似的現(xiàn)象，以及這些過程是否與抗生素引起的腸道微生物破壞的影響有關?；谘芯堪l(fā)現(xiàn)，連續(xù)用藥14d后，處理組大鼠的AUC和Cmax明顯高于對照組，其中AUC分別增加39.42-94.92%（20mg/kg）和44.78-151.43%（2mg/kg）。與此同時，測定了腸道微生物的數(shù)量和組成，探究抗生素混合暴露對腸道菌群的影響。如圖3所示，對照組與處理組之間初始細菌總數(shù)無顯著差異，但抗生素雞尾酒療法14天后，與未處理的相比，抗生素處理組的大鼠其細菌數(shù)量明顯減少（P<0.01）?；?/span>Shannon指數(shù)，PCoA分析以及物種組成，在經(jīng)過抗生素雞尾酒處理14d后，腸道內(nèi)微生物多樣性以及微生物群落組成也有顯著的改變（圖S6）。不同腸道細菌屬如Ruminococcaceae和Anaerotruncus所占百分比同樣有所改變（圖S6c）。 圖S6 抗生素雞尾酒處理14 d對微生物多樣性和組成的影響(n=5)。A：微生物多樣性Shannon指數(shù)（獨立樣本t檢驗，*P<0.001），B：Bray-Curtis比較的主坐標分析(PCoA)，顯示氨芐青霉素處理與未處理大鼠糞便微生物組成不同；C：根據(jù)抗生素雞尾酒處理14d后的大鼠與未用處理大鼠相比，微生物種類發(fā)生顯著變化的熱圖（不同顏色的值代表物種的相對多度，獨立樣本t檢驗，P<0.05被認為有顯著性差異）。 3 三嗪類除草劑的體外微生物代謝和微粒體代謝 腸道微生物可以通過多種方式影響異物類代謝，已有的研究表明，抗生素可以通過影響活性腸道微生物的生理和基因表達，進而影響微生物對外源物質(zhì)的代謝。為了探討抗生素對大鼠腸道對三嗪類除草劑降解的影響，進而引起生物利用率的增加，在厭氧條件下，采用大鼠糞便細菌體外培養(yǎng)的方法，對大鼠腸道的代謝進行了研究。在降解實驗中，初始三嗪類除草劑濃度分別設定為2 mg/l和0.02 mg/l。無論是在無菌培養(yǎng)基中，還是在抗生素處理和未用抗生素的大鼠的細菌培養(yǎng)中，三嗪類除草劑均未被代謝。結(jié)果表明，微生物對除草劑的代謝對提高除草劑的生物利用度貢獻不大（圖S7-S8）。大量抗生素的治療可以明顯改變腸道微生物菌群，但也可能影響宿主的代謝功能。在抗生素處理的模型中，抗生素的攝入可能會直接影響大鼠的肝臟代謝，這也可能導致農(nóng)藥生物利用率的增加。由于肝臟微粒體由于富含細胞色素P450等代謝酶，是目前最受歡迎的異物類代謝模型。因此本研究采用離體肝微粒體模型，探究抗生素對三嗪類除草劑肝臟代謝的影響。本實驗所用抗生素（氨芐西林、新霉素、慶大霉素、甲硝唑、萬古霉素）吸收率較低，灌胃后大鼠血中抗生素濃度為7 mg/L以下。因此，在微粒體培養(yǎng)體系中加入7 mg/L的抗生素混合物與除草劑復配。結(jié)果表明，與對照組相比，抗生素對三嗪類除草劑的微粒體代謝無明顯影響（圖S9）。這些結(jié)果表明，抗生素可能不會在短時間內(nèi)通過抑制酶而直接影響三嗪類除草劑的代謝?？股乜赡芡ㄟ^間接途徑影響三嗪類除草劑的生物利用度。 圖S7(A)氨芐青霉素處理3d和7d后和對照的大鼠的腸道菌群對2 mg/L的三嗪類除草劑的降解；(B)氨芐青霉素處理3d和7d后和對照的大鼠的腸道菌群對0.02 mg/L的三嗪類除草劑的降解(n=5)。
圖S8 (A)抗生素雞尾酒處理14d后和對照的大鼠的腸道菌群對2 mg/L的三嗪類除草劑的降解；(B)抗生素雞尾酒處理14d后和對照的大鼠的腸道菌群對0.02 mg/L的三嗪類除草劑的降解(n=5)。
圖S9 抗生素對三嗪類除草劑在肝微粒體中代謝的影響（n=3）。 4 腸道微生物群對三嗪類除草劑生物利用率的影響 由于腸道微生物菌群對三嗪類除草劑生物利用率的影響在抗生素處理的大鼠中不能直接評估。因此，我們設計了一個以腸道微生物菌群為唯一變量的實驗來研究三嗪類除草劑的生物利用率。如圖4所示，經(jīng)過14天的抗生素雞尾酒治療，兩組大鼠達到了幾乎無菌的狀態(tài)。經(jīng)過3天的沖洗期后，將經(jīng)抗生素處理和未使用抗生素的大鼠的腸道微生物菌群連續(xù)4天轉(zhuǎn)移到這些大鼠身上，以獲得一個缺陷菌群組（DM組）和一個正常菌群組（NM組）。所有大鼠口服2 mg/kg三嗪類除草劑。對抗生素處理的微生物轉(zhuǎn)移前（BAT）的大鼠的糞便樣本，正常處理的微生物轉(zhuǎn)移前（BNT）的大鼠的糞便樣本進行收集，同樣收集抗生素處理的微生物轉(zhuǎn)移后（AAT）的大鼠的糞便樣本，正常處理的微生物轉(zhuǎn)移后（ANT）的大鼠的糞便樣本，以評價腸道微生物的組成和豐度。在微生物菌群移植前，兩組間細菌總數(shù)無顯著差異，微生物多樣性相似（圖5a和圖5b）。微生物菌群移植后，正常微生物菌群大鼠的微生物量明顯增加，而微生物菌群缺陷組的微生物量沒有明顯變化。正常微生物菌群大鼠糞便細菌總豐度是缺菌菌群的近9倍（P<0.001，圖5a），基于Shannon指數(shù)，正常大鼠的微生物多樣性也比缺乏的大鼠有所增加（圖5b）。同時，PCoA分析發(fā)現(xiàn)正常大鼠的微生物和缺陷大鼠的微生物組成上有所不同（圖5C）。三嗪類除草劑的AUC均顯著高于正常菌群大鼠（P<0.05，圖6）。結(jié)果表明，腸道微生物菌群缺陷增加了三嗪類除草劑在大鼠體內(nèi)的口服生物利用率，從而直接反映了腸道微生物區(qū)系對農(nóng)藥生物利用率的影響。
圖4 抗生素雞尾酒治療大鼠微生物轉(zhuǎn)移模型的實驗設計。兩組大鼠經(jīng)抗生素雞尾酒治療14d后，均接近無菌狀態(tài)，移植抗生素處理組和未處理組大鼠腸道菌群4d，獲得缺失菌群組和正常菌群組(n=11)。分別于移植前和移植后收集大鼠新鮮糞便，移植后處死大鼠收集肝臟和小腸粘膜(BAT：抗生素處理微生物群轉(zhuǎn)移前；BNT：正常處理微生物群轉(zhuǎn)移前；AAT：抗生素處理微生物群轉(zhuǎn)移后；ANT：正常處理微生物群轉(zhuǎn)移后，n=5)。其余6只大鼠用于測定農(nóng)藥的生物利用度(n=6)。紅星意味著農(nóng)藥接觸的開始。
圖5大鼠腸道微生物區(qū)系移植前后的差異(BAT：抗生素處理微生物區(qū)系移植前；BNT：正常處理微生物區(qū)系移植前；AAT：抗生素處理微生物區(qū)系移植后；ANT：正常處理微生物區(qū)系移植后，n=5)。a原核16S rRNA基因在糞便中的拷貝數(shù)(*P<0.001)。b微生物多樣性的Shannon指數(shù)(*P<0.05)。c代表Bray-Curtis計算的主坐標分析(PCoA)表明BAT、BNT、AAT和螞蟻樣品的微生物組成不同。
圖6 腸道微生物菌群對三嗪類除草劑血藥濃度的影響。柱狀圖顯示三嗪類除草劑的AUC，缺陷型微生物區(qū)系大鼠的AUC與正常微生物區(qū)系大鼠(DM組：缺陷型微生物區(qū)大鼠；NM組：正常微生物區(qū)系大鼠；獨立樣本t檢驗，*P<0.05，n=6)的AUC增加率比較(P<0.05，n=6)。 5 腸道微生物群改變肝臟代謝和腸道吸收相關蛋白質(zhì)組 為了探究腸道微生物影響三嗪類除草劑生物利用率的機理，我們分析了大鼠小腸微生物群移植后肝臟代謝酶的表達，并進行了蛋白質(zhì)組學研究。肝臟酶包括細胞色素P450酶(Cyps)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與了三嗪類除草劑的代謝，并通過觀察加入相關酶抑制劑對三嗪類除草劑代謝的抑制作用，在肝臟微粒體代謝實驗中驗證了它們的活性。與正常菌群大鼠相比，微生物群缺陷大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP2D2、CYP2E1、CYP3A2、CYP3A11、GSTYc2和GSTM2酶的mRNA表達降低。這些結(jié)果表明，三嗪類除草劑的代謝可能由于代謝酶的下調(diào)而降低，這有助于解釋為什么缺乏微生物菌群的大鼠的生物利用度增加（圖7a）。 口服引入的外源化合物的攝取主要發(fā)生在小腸。采用無標記蛋白質(zhì)組學方法，研究了腸道微生物菌群對外源化合物腸道吸收的影響。通過對微生物區(qū)系缺陷大鼠和正常微生物區(qū)系大鼠的比較，在回腸末端的粘膜中共鑒定出77種顯著不同的蛋白質(zhì)。與正常菌群大鼠相比，缺陷型微生物區(qū)系大鼠有14種蛋白質(zhì)減少，而63種蛋白質(zhì)增加。在這些改變的蛋白質(zhì)中，Slc3a1（登錄號為Q64 319）是一種被證明具有外源轉(zhuǎn)運能力的蛋白質(zhì)，與正常微生物區(qū)系大鼠相比，缺失微生物區(qū)系大鼠的SLc3a1蛋白表達上調(diào)（P<0.05，圖7b）。與藥物吸收和轉(zhuǎn)運相關的其他蛋白質(zhì)的顯著變化并不明顯。因此，腸道微生物菌群缺陷對異種生物吸收的影響可能不大，腸道微生物菌群通過上調(diào)轉(zhuǎn)運蛋白促進腸道吸收的途徑可能不是導致腸道微生物區(qū)系缺陷大鼠生物利用度增加的最重要原因。
圖7 a代表微生物菌群缺陷大鼠和正常微生物區(qū)系大鼠肝臟代謝酶mRNA的相對表達。b代表Slc3a1蛋白在缺菌鼠和正常菌群大鼠小腸黏膜中的相對表達(獨立樣本t檢驗，P<0.05，n=5)。 討 論 在此，我們評估了抗生素對大鼠體內(nèi)農(nóng)藥生物利用率的影響，并對其機制進行了研究?？诜侯惓輨┖螅瑔斡靡环N抗生素（氨芐青霉素）或采用抗生素雞尾酒治療的大鼠的生物利用率增加。為了評估腸道微生物菌群是否影響農(nóng)藥的生物利用率，我們建立了一個微生物菌群轉(zhuǎn)移模型，以直接證明腸道微生物菌群缺陷通過改變肝臟代謝酶和小腸吸收相關蛋白的mRNA表達而增加了農(nóng)藥的生物利用度。綜上所述，抗生素可以提高三嗪類除草劑的生物利用率，從而增加暴露風險。這些結(jié)果還提出了抗生素影響外源生物利用率的一種新的潛在途徑，并暗示腸道微生物菌群可能影響外源化合物在宿主中的命運。濫用抗生素可能會增加與殺蟲劑等外來生物有關的風險，并放大其相應的毒性效應。 評 論 農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可缺少的，已有研究表明，農(nóng)藥殘留物可以穿過食物鏈，并最終對人類健康構(gòu)成威脅?？股卦诳刂萍膊『徒档筒≡w相關死亡率方面發(fā)揮著重要作用，基于研究發(fā)現(xiàn)抗生素和農(nóng)藥具有相同的暴露途徑，可以通過食物鏈進入人體中，因此了解抗生素與農(nóng)藥的相互作用有助于進一步評價其在環(huán)境中的潛在風險。在本研究中，作者評估了抗生素對大鼠口服暴露后五種典型變態(tài)反應的影響。首先給大鼠使用一種常用的抗生素，這種抗生素的劑量與普通抗生素的劑量相當。通過研究發(fā)現(xiàn)抗生素可以提高三嗪類除草劑的生物利用率，從而增加暴露風險，進一步警示了抗生素與農(nóng)藥濫用對人體的潛在風險。對評價僅是小編的個人看法，歡迎大家一起進行討論。
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