摘要▼

分子診斷技術(shù)的發(fā)展加速推進(jìn)了兒童感染性疾病病原體核酸檢測(cè)向高通量、高靈敏度、自動(dòng)化發(fā)展的進(jìn)程。在臨床常用的熒光定量PCR技術(shù)之外，多重PCR技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、微流控芯片的應(yīng)用使病原體核酸檢測(cè)在通量和靈敏度上有了顯著提升，這些技術(shù)配合一體機(jī)的使用實(shí)現(xiàn)了兒童感染性疾病病原體核酸檢測(cè)的自動(dòng)化和高通量化。高通量測(cè)序技術(shù)可以最大程度獲取標(biāo)本中幾乎所有病原體的核酸信息，已逐漸成為臨床感染性疾病診斷的重要輔助手段。

由于兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，感染性疾病成為兒童最為常見(jiàn)的疾病，2013年全球有3.26億5歲以下兒童死于感染性疾病，占所有5歲以下兒童死亡數(shù)的50%以上。病原微生物的早期、快速、準(zhǔn)確診斷在感染性疾病的診斷、治療和預(yù)防中起著至關(guān)重要的作用。隨著近年來(lái)分子診斷技術(shù)的不斷創(chuàng)新，感染性疾病病原體核酸檢測(cè)技術(shù)也取得了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

一、兒童臨床病原體核酸檢測(cè)現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)

兒童感染性疾病具有病原微生物多樣性、復(fù)雜性、載量低等特點(diǎn)。目前，病原學(xué)核酸檢測(cè)主要依賴于PCR技術(shù)，尤以熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛。熒光定量PCR技術(shù)因其實(shí)時(shí)定量、閉管檢測(cè)、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、衣原體和病原體耐藥基因等臨床病原學(xué)核酸檢測(cè)領(lǐng)域。但該技術(shù)也存在通量過(guò)低、檢測(cè)靈敏度有限等缺點(diǎn)，不適用于臨床多種病原體的同時(shí)檢測(cè)以及特殊低載量病原體樣本的檢測(cè)。同時(shí)，國(guó)內(nèi)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染性PCR實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化程度不高，也限制了該技術(shù)進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。自動(dòng)化、高通量、高靈敏度必然是未來(lái)兒童感染性疾病核酸檢測(cè)的發(fā)展方向。

二、兒童病原體核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及臨床應(yīng)用

（一）基于PCR技術(shù)的病原體核酸檢測(cè)

為了克服熒光定量PCR技術(shù)通量低、靈敏度有限的缺點(diǎn)，目前新開(kāi)發(fā)的臨床常見(jiàn)病原體核酸檢測(cè)技術(shù)主要包括多重PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。

1．多重PCR技術(shù)：

主要應(yīng)用多重引物，針對(duì)不同的病原體核酸或耐藥基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)不同病原體擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異來(lái)判斷何種病原體感染，也可以同時(shí)檢測(cè)同一樣本中的細(xì)菌、病毒、支原體等臨床常見(jiàn)病原體及其耐藥基因。該技術(shù)早期主要通過(guò)凝膠電泳和毛細(xì)管電泳人工來(lái)判斷結(jié)果，如黃烈等建立了多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等9種兒童常見(jiàn)的呼吸道病毒，最終通過(guò)凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物大小來(lái)判斷病毒類型；張海鄰等建立了同時(shí)檢測(cè)病毒、衣原體等11種兒童常見(jiàn)呼吸道感染病原微生物的多重PCR體系，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)毛細(xì)管電泳法進(jìn)行分析。但該技術(shù)存在擴(kuò)增產(chǎn)物易污染的缺點(diǎn)。近幾年一些企業(yè)已將PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳做成一體機(jī)用于兒童感染性疾病的病原學(xué)檢測(cè)，封閉檢測(cè)降低了核酸污染機(jī)率，并通過(guò)機(jī)器判讀結(jié)果，減少了檢驗(yàn)人員的操作誤差和工作量。一體機(jī)使PCR技術(shù)擺脫了場(chǎng)地和熒光定量PCR儀的限制，更適合門診或基層兒童感染性疾病病原學(xué)核酸檢測(cè)的快速普及。

2．?dāng)?shù)字PCR技術(shù)：

包含列陣數(shù)字PCR、磁珠乳液擴(kuò)增方法（beads，emulsion，amplification，and magnetics，BEAMing）數(shù)字PCR和微滴數(shù)字PCR。其中微滴數(shù)字PCR應(yīng)用最為廣泛，該系統(tǒng)要求在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增前把測(cè)試樣本分割為成千上萬(wàn)的水包油微滴，分割后每個(gè)微滴成為1個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系，可以實(shí)現(xiàn)病原微生物的絕對(duì)定量，將PCR靈敏度提升了10~100倍。在兒科感染領(lǐng)域，微滴數(shù)字PCR主要應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)等病原微生物的精準(zhǔn)定量檢測(cè)，如結(jié)核桿菌、HBV、HIV和瘧原蟲(chóng)等，進(jìn)而指導(dǎo)臨床診斷和治療^[10,11,12]。

（二）基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的病原體核酸檢測(cè)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)恒定溫度下擴(kuò)增目標(biāo)核酸片段，不僅避免了PCR反應(yīng)的升、降溫過(guò)程，縮短了擴(kuò)增時(shí)間，而且擺脫了PCR儀的限制，能更好地適用于基層醫(yī)院。依據(jù)等溫?cái)U(kuò)增酶及引物設(shè)計(jì)的特性，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增（simultaneous amplification and testing，SAT）、酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）。

1．LAMP技術(shù)：

在病原體核酸的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，通過(guò)一系列的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)病原體基因片段的擴(kuò)增，由于在體系中加入了Mn²⁺鈣黃綠素復(fù)合物，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的大量焦磷酸根離子可與Mn²⁺結(jié)合釋放鈣黃綠素，因而有利于反應(yīng)結(jié)果的觀測(cè)，使擴(kuò)增和檢測(cè)只需一步便可完成，大大提高了檢測(cè)效率。但LAMP技術(shù)難以區(qū)別非特異性擴(kuò)增和極易受污染影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

2．SAT技術(shù)：

將病原體靶RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），再利用T7噬菌體酶將cDNA轉(zhuǎn)錄為RNA，通過(guò)頸環(huán)RNA探針識(shí)別RNA產(chǎn)物釋放熒光，然后產(chǎn)物RNA不斷重復(fù)上述過(guò)程，由于每個(gè)循環(huán)可放大100~1 000倍熒光信號(hào)，其靈敏度至少可以達(dá)到10¹CFU/ml，優(yōu)于熒光定量PCR技術(shù)。同時(shí)，SAT技術(shù)的靶標(biāo)為RNA，可提示以DNA為核酸的病原體的現(xiàn)癥感染，目前在兒科感染領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用于兒童肺炎支原體和結(jié)核桿菌的診斷和療效監(jiān)測(cè)。

3．ERA技術(shù)：

該技術(shù)可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，樣本的處理只需吸取200微升的細(xì)胞懸95℃水浴2分鐘作為模板，反應(yīng)體系需置于熒光定量檢測(cè)儀中進(jìn)行，設(shè)置溫度為37℃，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20分鐘內(nèi)完成，觀察熒光定量檢測(cè)儀顯示的擴(kuò)增曲線判讀檢測(cè)結(jié)果。

該產(chǎn)品現(xiàn)處于科研品，是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，靈敏度比PCR高10-100倍，可以在恒定的低溫條件下進(jìn)行，而且用時(shí)在30分鐘以內(nèi)，并且檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測(cè)方法。

（三）基于基因芯片技術(shù)的病原體核酸檢測(cè)

基因芯片是將特異的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，與目的片段進(jìn)行識(shí)別和雜交，通過(guò)特定的檢測(cè)系統(tǒng)和分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀。根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)的不同，基因芯片主要包括DNA芯片和RNA芯片。近年來(lái)兒科感染性疾病病原體檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展最快的是微流控芯片技術(shù)。核酸檢測(cè)微流控芯片將不同的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)縮微在玻璃或者塑料基質(zhì)上，在微米級(jí)的尺度上構(gòu)建出液流通道、核酸提取池、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增池、雜交池等部件，整合了樣本處理、反應(yīng)、檢測(cè)的全部過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)多種病原體或進(jìn)行病原微生物的分型，但目前尚存在單次檢測(cè)樣本量過(guò)低的缺點(diǎn)。微流控技術(shù)在檢測(cè)諾如病毒、輪狀病毒、星狀病毒等兒童常見(jiàn)腹瀉病毒方面的應(yīng)用已有文獻(xiàn)報(bào)道，未來(lái)該技術(shù)有望為兒科感染性疾病的病原學(xué)檢測(cè)注入新的活力。

三、結(jié)語(yǔ)與展望

分子診斷技術(shù)的發(fā)展加快了兒童感染性疾病病原學(xué)診斷的進(jìn)程。PCR技術(shù)依然是兒童感染性疾病病原體核酸檢測(cè)的主要檢測(cè)方法。微流控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)病原體核酸檢測(cè)的高通量、自動(dòng)化，適合臨床兒童感染的多種病原篩查，有望顯著提高兒童感染性疾病病原學(xué)診斷的能力和效率?？梢灶A(yù)見(jiàn)，分子診斷技術(shù)推動(dòng)下的兒童感染性疾病病原體核酸檢測(cè)技術(shù)未來(lái)必然朝著高通量、自動(dòng)化的方向發(fā)展，成為感染性疾病診斷的主要方法。