|
基因克隆的引物設(shè)計(jì)及目的DNA片段的擴(kuò)增，與常規(guī)PCR法是相同的。唯一的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個(gè)同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上了15-20個(gè)與載體序列同源性的堿基。通過相關(guān)酶試劑處理，同時(shí)除去載體與目的DNA上同源片段的雙鏈中的一條鏈，這樣載體和目的DNA兩端就露出了能夠互補(bǔ)配對(duì)的序列，依靠同源序列堿基間的配對(duì)能使載體和目的DNA較為緊密的連在一起而無需酶聯(lián)，直接用于轉(zhuǎn)化。 傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物克隆方法主要有兩種：一種是PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)引入載體上的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后定向克隆到目的載體上；另一種是TA載體連接。這兩種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，過程繁冗。 無縫克隆和組裝技術(shù)是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶。突破傳統(tǒng)的雙酶切再加上連接，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體。 1、位點(diǎn)選擇靈活：載體任意位置基因克??； 2、快速簡便：省略酶切、割膠回收、酶連等過程，大約1h完成載體構(gòu)建； 3、精確：不需要增加任何額外的程序； 4、克隆效率高，陽性克隆高達(dá)90%以上； 5、一次進(jìn)行多片段目的基因的重組；   優(yōu)點(diǎn)： · 開放的技術(shù)平臺(tái)，任何質(zhì)粒、任意位置、任何目的基因都能適用，位點(diǎn) 選擇靈活。 · 使得PCR產(chǎn)物克隆徹底擺脫了中間載體、重復(fù)亞克隆重復(fù)篩選的煩惱， 一步進(jìn)行多片段目的基因的無縫拼接，不受PCR產(chǎn)物末端影響。 · 速度快，操作簡便，重組效率高。 缺點(diǎn)： · 需要通過PCR，目的基因不易在不同載體間穿梭 · 某些時(shí)候重復(fù)序列或者粘性末端形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響成功率。 |
|
|
