1. 宏病毒組的研究背景

被稱為人體第二基因組的人體微生物組((human microbiome)是人體內(nèi)外表面所有微生物所攜帶遺傳物質(zhì)的總稱(Sender R, et al, 2016)。全球各國對這一新興領(lǐng)域異常重視，并啟動了多項(xiàng)微生物組研究計(jì)劃，例如，由法國農(nóng)業(yè)研究院2005牽頭發(fā)起并于2008年正式成立了國際人體微生物組聯(lián)盟；2008年，由美國國立衛(wèi)生研究院主導(dǎo)啟動了人體微生物組計(jì)劃(Human Microbiome Project, HMP)(Methé Barbara A, et al, 2012)；及歐盟于2008年啟動的“人體腸道微生物宏基因組學(xué)(Metagenomics of Human Intestinal Tract MetaHIT)計(jì)劃”，在其第七框架計(jì)劃下，歐盟將目光聚焦在了特定的微生物組領(lǐng)域。這些計(jì)劃的開展，揭示了人體微生物復(fù)雜的組成成分(圖1)，包括細(xì)菌、真菌、人感染病毒、專一性感染細(xì)菌的噬菌體等，這些微生物之間相互作用，維持人體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡，影響著人體的健康。

  圖1 人體微生物組的主要組成成分(Rowan-Nash AD, et al, 2019)

隨著腸道基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，人們開始將目光轉(zhuǎn)向人類腸道中體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)菌，自身結(jié)構(gòu)中又無細(xì)胞核的病毒身上，目前，病毒組的研究迎來了嶄新的階段，高通量測序技術(shù)和生物信息分析方法的發(fā)展為病毒組學(xué)的研究提供了必要的支持，使系統(tǒng)水平的復(fù)雜微生物群落研究不再是天方夜譚。

1.1宏病毒組簡介

1991年Schmidt(Schmidt TM, et al, 1991)首次提出的環(huán)境基因組學(xué)(Environmental genomics)被視為宏基因組學(xué)的前身，當(dāng)時(shí)Schmidt等構(gòu)建了世界上第一個(gè)海洋生物樣本DNA的噬菌體文庫，并從中發(fā)現(xiàn)了15種全新的細(xì)菌核酸序列。1998年，Handelsman等(Handelsman J, et al, 1998)提出研究特定環(huán)境樣本中遺傳物質(zhì)的總和的課題，并將特定小生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和定義為宏基因組(Metagenome) 。2004年Handelsman (Handelsman J, et al, 2004)完整闡述了宏基因組學(xué)(Metagenomics)的概念，即以某一特定環(huán)境樣本中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和序列測定分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互作用及其與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的一種新的微生物研究方法。

宏病毒組學(xué)(Viral Metagenomics)是宏基因組學(xué)的一個(gè)分支，但與傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)概念不同，它是在宏基因組學(xué)概念的基礎(chǔ)上，結(jié)合病毒自身的特點(diǎn)，將宏基因組學(xué)方法應(yīng)用到病毒學(xué)領(lǐng)域而形成的。2002年，Breitbart等(Breitbart M, et al, 2002)將宏基因組學(xué)方法應(yīng)用于海洋病毒群落的研究，發(fā)現(xiàn)噬菌體為海水中主要病毒組，這一研究標(biāo)志著宏病毒組學(xué)正式應(yīng)用于科學(xué)研究。

簡而言之，宏病毒組學(xué)就是應(yīng)用特殊方法把特定環(huán)境中所有病毒與其他微生物分開，然后提取的病毒核酸，用高通量技術(shù)進(jìn)行病毒核酸測序，最后將測序結(jié)果與現(xiàn)有的核酸文庫進(jìn)行比對，并運(yùn)用軟件分析處理后最終得到研究樣品中病毒群落的組成信息。

1.2 宏基因組時(shí)代下的病毒組

1.2.1 病毒的組成與分類

病毒是地球上數(shù)量最多的生物實(shí)體，其中細(xì)菌病毒(即噬菌體)約有10³¹個(gè)種群，從海洋到陸地再到人體幾乎都是它們的棲息地。研究者將病毒視為調(diào)節(jié)人類生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，人體內(nèi)主要包括真核病毒和噬菌體，包括雙鏈DNA (double-stranded DNA, dsDNA)，單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA)和RNA病毒。隨著對病毒研究的廣泛開展，“病毒組”與“病毒組學(xué)”的概念也應(yīng)運(yùn)而生，這些術(shù)語分別涵蓋了棲息在生態(tài)系統(tǒng)中的所有病毒及其基因組和對它們的研究(Lefkowitz EJ, et al, 2017)。根據(jù)病毒不同的特征進(jìn)行分類，包括病毒的宿主范圍；病毒的形態(tài)學(xué)；病毒的基因組大??；病毒的核酸組成成分以及病毒的致病性(圖2)。雖然所有的性狀在病毒分類學(xué)的確定中都很重要，但目前利用平均核苷酸同源性（ANI）和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行序列比較被視為定義和區(qū)分病毒群類的主要標(biāo)準(zhǔn)。

 圖2 基于不同特征對病毒進(jìn)行分類(Garmaeva S, et al, 2019)

此外，病毒也被發(fā)現(xiàn)潛伏在人類細(xì)胞內(nèi)，如人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses, HERVs)，原病毒，或外鞘。一部分病毒已經(jīng)失去了重新激活的能力(例如某些HERVs)，另一部分可以重新激活但作為原病毒保留很長一段時(shí)間，其它部分則呈現(xiàn)周期性的動態(tài)循環(huán)(周期性產(chǎn)生病毒顆粒并頻繁感染)。

另一方面，噬菌體通過與我們體內(nèi)細(xì)菌群落的相互作用，從而可以參與調(diào)節(jié)人體菌群，對細(xì)菌的部分功能基因進(jìn)行儲存，并通過與機(jī)體免疫系統(tǒng)的互作，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟(圖3)。

圖3 人類病毒組(Forterre, et al, 2017)

已有大量研究致力于描述病毒群落的特征及它在塑造微生物群方面的作用，然而，不同于細(xì)菌和真菌，噬菌體或真核病毒并沒有通用的標(biāo)記基因可以將其作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，因此，宏基因組方法經(jīng)常被使用，宏基因組測序和透射電鏡技術(shù)的研究證實(shí)，人體內(nèi)外已發(fā)現(xiàn) 的病毒多數(shù)為噬菌體(包括腸道、口腔、皮膚、呼吸道和尿道, 其中對腸道的研究最多)(Lee SC, et al, 2014)。對人體腸道病毒組的相關(guān)研究首次見于2003年，研究者通過鳥槍測序法對分離自健康成人糞便的病毒顆粒物進(jìn)行了測序，該研究估計(jì)成人糞便樣品中大約有1200種病毒，其中多為長尾噬菌體科（Siphoviridae)。

1.2.2 噬菌體:生態(tài)系統(tǒng)中的動態(tài)參與者

噬菌體是數(shù)量最多的一種病毒，被視為在細(xì)菌宿主中繁殖的強(qiáng)制性寄生蟲。其潛在的宿主范圍是噬菌體特異性所決定的，從一個(gè)菌株到多種細(xì)菌種類不等。在感染過程中，噬菌體附著于細(xì)菌表面，并將自己的遺傳物質(zhì)插入細(xì)胞。然后，噬菌體遵循兩種主要生命周期之一:溶解周期或溶原周期(Mao Ye, et al, 2019)

  圖4 噬菌體在溶解和溶原循環(huán)中的作用 (Mao Ye, et al, 2019)

溶解周期對宿主細(xì)胞是致命的，并最終產(chǎn)生新的噬菌體，具有溶解周期病毒的最著名例子是以感染大腸桿菌為主的T7和Mu噬菌體。這些噬菌體最初侵入了細(xì)菌細(xì)胞，制造病毒顆粒；隨后細(xì)菌細(xì)胞被裂解，釋放100-200個(gè)病毒顆粒到周圍環(huán)境中，可以持續(xù)感染新的細(xì)菌細(xì)胞。由此，噬菌體可以在調(diào)節(jié)宿主細(xì)菌豐度方面發(fā)揮重要作用。

相反，溶原循環(huán)指的是噬菌體復(fù)制，該過程不會直接導(dǎo)致病毒顆粒的產(chǎn)生。噬菌體通過溶原性轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將基因從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，這種能力可以使得病毒種類及其相關(guān)細(xì)菌宿主種類的多樣性增加。溶原循環(huán)的發(fā)生，可以介導(dǎo)細(xì)菌中的毒素、毒力基因、甚至抗生素抗性基因在細(xì)菌種群中傳播。溫和噬菌體中相對最著名的例子就是霍亂弧菌的CTXφ噬菌體，該噬菌體可以通過在宿主中插入引起腹瀉的毒素編碼基因，從而改變細(xì)菌宿主的毒性。但是在某些條件下，比如DNA損傷或低養(yǎng)分條件(紫外線、溫度、輻射、抗斑點(diǎn)劑、重金屬等)，這些噬菌體可以自發(fā)地從宿主基因組中分離出來(這種分離被稱為誘導(dǎo)分離)，而后進(jìn)入裂解循環(huán)。

Referrences:

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Ye Mao, Sun Mingming, Huang Dan, et al. A review of bacteriophage therapy for pathogenic bacteria inactivation in the soil environment. Environment International, 2019, 129: 488-496.

Schmidt TM, DeLong EF, Pace N R. Analysis of a marine picoplankton community by 16SrRNA gene cloning and sequencing[J]. J Bacteriol, 1991,173 (14):4371-4378.

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