1 文章信息題目：Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial 發(fā)表日期：2019年6月19日 雜志：Mol Syst Biol 文章在：https://www./doi/10.15252/msb.20188746 DOI：https:///10.15252/msb.20188746  圖1 2 摘要單細(xì)胞領(lǐng)域日新月異，大量的工具被開發(fā)出來，但很難去判斷是否好用，而且如何組建一個分析流程是一個難點。本文將詳細(xì)介紹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的步驟，包括預(yù)處理（質(zhì)控、歸一化標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)矯正、挑選基因、降維）以及細(xì)胞和基因?qū)用娴南掠畏治?。并且作者將整個流程應(yīng)用在了一個公共數(shù)據(jù)集作為展示（詳細(xì)說明在：https://www.github.com/theislab/single-cell-tutorial），目的是幫助新入坑用戶建立一個知識體系，已入坑用戶更新知識體系。 3 前言
現(xiàn)在已經(jīng)可以利用scRNA研究斑馬魚、青蛙、渦蟲的細(xì)胞異質(zhì)性(Briggs et al, 2018; Plass et al, 2018; Wagner et al, 2018) ，重新理解以前的細(xì)胞群體，但這個領(lǐng)域面臨的一個問題就是沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)化流程。標(biāo)準(zhǔn)化之路的困難有：大量分析方法和工具的誕生（截止2019.3.7 已經(jīng)有385種工具）、爆炸式增長的數(shù)據(jù)量(Angerer et al, 2017; Zappia et al, 2018)。另外根據(jù)不同研究目的，各種分支也突顯，例如在細(xì)胞分化過程中預(yù)測細(xì)胞命運(yùn)(La Manno et al, 2018)。在我們眼界大開的同時，分析流程標(biāo)準(zhǔn)化就變得更加困難。 在未來分析流程標(biāo)準(zhǔn)化之路上，困難還會存在于技術(shù)整合層面。比如現(xiàn)在大量的scRNA工具都是用R和Python寫的，跨平臺分析需求在增長，而對編程語言的喜好也決定了工具的選擇。很多好用的分析工具將自己限制在用各自的編程語言開發(fā)的環(huán)境中，例如Seurat、Scater、Scanpy。 接下來，就一起看看作者列出了哪些他認(rèn)為比較好的軟件和流程吧 先上一個scRNA分析總體流程圖：  圖2 4 預(yù)處理和可視化4.1 首先看一下實驗過程比較詳細(xì)的介紹可以看：Ziegenhain et al (2017); Macosko et al (2015); Svensson et al (2017). 原文描述的關(guān)鍵點是：
感覺原文描述的還沒有illumina給出的詳細(xì)，那么就看看illumina的圖文并茂版：
 圖3  圖4 原始測序數(shù)據(jù)要經(jīng)過處理得到表達(dá)矩陣，注意這里有兩種表述方式：molecular counts (count matrices) 【也即是使用UMI的】和 read counts (read matrices)，取決于是否使用UMI。而作者介紹的流程中，默認(rèn)使用 count matrices，除非readmatrices和 count matrices得到的結(jié)果存在差異，才會特別介紹read matrices
原始數(shù)據(jù)處理工具主要有：CellRanger、indrops、SEQC、zUMIs 它們主要做了這么幾件事：
得到的矩陣行是轉(zhuǎn)錄本，列是barcodes【這里用barcodes而不是直接叫細(xì)胞，是因為不同細(xì)胞的reads也可能屬于同一個barcode =》如果出現(xiàn)一孔/液滴多細(xì)胞（doublet情況），那么barcode在多個細(xì)胞都是一樣的】當(dāng)然也會出現(xiàn)有barcode但實際沒有細(xì)胞的情況（一個孔/液滴沒有細(xì)胞即droplet，但這個孔/液滴也會賦予barcode）
關(guān)于10X實驗環(huán)節(jié)，可以看我之前寫的：https://mp.weixin.qq.com/s/0DEybX7GnuDFhfY1uj9t9A  圖5 4.2 質(zhì)控在正式分析之前，先要確定barcode是不是對應(yīng)真正的細(xì)胞（上面已經(jīng)了解了barcode和細(xì)胞的關(guān)系），也就是進(jìn)行Cell QC，主要考慮三個因素（這幾個因素也就是現(xiàn)在流程中常用的過濾指標(biāo)）：
先看圖A：其中這個小的直方圖就是把count depth小于4000的放大，這里設(shè)定了一個閾值1500，也就是一個barcode中至少有1500的表達(dá)量 圖B：每個細(xì)胞中包含的基因數(shù)直方圖?？梢钥吹綑M坐標(biāo)有一個小的峰在400附近，這里設(shè)定的閾值是700 圖C：依舊是看count depth。從高到低排列count depth值，可以過濾一些空的液滴（empty droplets），看到從”肘部“也就是縱坐標(biāo)1500左右開始迅速下降 圖D：看線粒體比例。如果占比很高并且細(xì)胞類型不是線粒體特別豐富的那種（如心肌細(xì)胞），可能說明這個細(xì)胞本身的基因數(shù)不多并且總體表達(dá)量也不高  圖6 以上三個指標(biāo)固然重要，但如果只關(guān)注其中某一個，也會產(chǎn)生誤導(dǎo)作用，所以作者建議看問題一定要全面，并且要把數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識結(jié)合起來。作者舉了個例子：比如線粒體表達(dá)量相對較高的細(xì)胞也可能參與了呼吸過程。細(xì)胞總體表達(dá)量低或者基因數(shù)量少，也可能是因為當(dāng)時取的細(xì)胞處于靜止；細(xì)胞表達(dá)量很高，也可能因為本身細(xì)胞體積就比較大。的確，細(xì)胞與細(xì)胞之間的總表達(dá)量還是存在較大差異的。未來也許QC會提供更多的選擇。 除了檢查細(xì)胞完整度，QC還要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本層面上的檢查。原始的count矩陣一般包含超過20000個基因。這里一般要根據(jù)在細(xì)胞中有表達(dá)的數(shù)量進(jìn)行過濾，但這個閾值要根據(jù)總體細(xì)胞數(shù)和預(yù)計的分群情況來靈活調(diào)整。比如有的細(xì)胞類型本身就數(shù)量比較少（也許就50個），那么如果我們要設(shè)定”在少于50個細(xì)胞中有表達(dá)的基因“這種條件，那么可能會丟失那些總共就50個細(xì)胞中的marker基因，最終導(dǎo)致鑒定的細(xì)胞亞群會缺失。 質(zhì)控的目的就是給下游提供更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，但一開始誰也不知道這個質(zhì)量高不高，只能先進(jìn)行下游分析，看看結(jié)果（比如細(xì)胞分群結(jié)果）再判斷。尤其是針對異質(zhì)性高的細(xì)胞群體
小結(jié)
4.3 歸一化/標(biāo)準(zhǔn)化
表達(dá)矩陣中的每個count值都表示成功的細(xì)胞捕獲、成功的反轉(zhuǎn)錄、成功的測序。但即使是相同類型的細(xì)胞，它們的count depth（也就是每個細(xì)胞的全部表達(dá)量）也會有變化，變化的來源就在于上面說的那三步。因此在比較兩個細(xì)胞時，任何差異都可能由于實驗測序誤差產(chǎn)生，而不是真的生物學(xué)差異。歸一化就是解決這個問題，它把要比較的兩個count值根據(jù)各自身處的環(huán)境求出一個相對豐度，也就是放在了一個水平上考慮，減少實驗測序誤差，突出更多的生物學(xué)差異。 最常用的歸一化方法就是：count depth scaling，也稱為counts per million（CPM），這個方法常用于bulk轉(zhuǎn)錄組，它會根據(jù)每個細(xì)胞的總表達(dá)量計算一個 size factor ，然后對其中各個基因表達(dá)量進(jìn)行normalize。
單細(xì)胞測序中使用的歸一化方法由于細(xì)胞種類和基因錯綜復(fù)雜，有人就在bulk的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改動。例如：Weinreb et al (2018) 先排除了表達(dá)量超過總體5%的基因，然后再計算size factor，主要是預(yù)防少量極高表達(dá)量基因的存在；Scran包有個pooling‐based size factor estimation方法，允許更高的細(xì)胞異質(zhì)性存在；另外Scran包在批次矯正和差異分析環(huán)節(jié)也比其他歸一化方法表現(xiàn)更好(Buttner et al, 2019)。 在單細(xì)胞RNA測序領(lǐng)域，目前有三種常用方法：其一是以10x Genomics為代表的微滴(droplet-based)測序；其二是以Namocell為代表的PCR板(plate-based)測序；其三是以BD Rhapsody為代表的微孔(micro-well-based)測序。就測序長度來說，Smart-seq/C1和Smart-seq2基于full length的測序方案，CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRBseq是基于UMI的測序方案。 不能指望某一種方法適用于所有類型的scRNA數(shù)據(jù)，(Cole et al, 2019)就發(fā)現(xiàn)不同的歸一化方法對于不同類型數(shù)據(jù)集表現(xiàn)不同，使用scone工具可以幫助選擇合適的方法。 一般在歸一化后，數(shù)據(jù)都會變成 使用log轉(zhuǎn)換的一個好處就是：讓數(shù)據(jù)更加集中，減少數(shù)據(jù)的偏斜度，從而近似于許多下游分析工具對數(shù)據(jù)為正態(tài)分布的假設(shè)（盡管scRNA數(shù)據(jù)并不是真正的符合正態(tài)分布），比如在差異表達(dá)分析和批次矯正環(huán)節(jié) 小結(jié)
4.4 數(shù)據(jù)矯正與整合數(shù)據(jù)矯正的對象種技術(shù)和生物因素都有，例如：不同批次、捕獲失?。╠ropout）、不同細(xì)胞周期。這些在之前的歸一化中沒有被矯正，但這些差異因素都可能會后面的分析產(chǎn)生影響，它們現(xiàn)在都是導(dǎo)致差異的”嫌疑人“之一。這里要做的就是把這些差異來源去掉（Regressing out 《=》【專門查的詞典】 同義詞partialling out ：剔除） 4.4.1 首先是生物因素最常見的生物矯正因素就是：轉(zhuǎn)錄組中的細(xì)胞周期信息。簡單一點的方式就像Scanpy和Seurat對細(xì)胞周期評分進(jìn)行簡單線性回歸；復(fù)雜點的方式就像scLVM和f‐scLVM。用來計算細(xì)胞周期分?jǐn)?shù)的marker基因可以從文獻(xiàn)中獲得 (Macosko et al, 2015)。另外，這些方法還能用來去除其他已知的生物因素，例如線粒體基因表達(dá)量（可以作為細(xì)胞應(yīng)激的標(biāo)記）。 需要注意的是：
4.4.2 然后是技術(shù)因素最常見的技術(shù)矯正因素就是：樣本測序深度、批次、噪音。 去除測序深度的影響，可以促進(jìn)軌跡推斷算法的表現(xiàn)，因為它需要在細(xì)胞之間找變化的路徑，只要放在同一水平才能看到更準(zhǔn)確的總體表達(dá)高低。 批次的來源可能是：細(xì)胞捕獲的時期不同、文庫制備使用的芯片不同、測序使用的lane不同。由此產(chǎn)生的效應(yīng)存在于多個層面:一次實驗中各個細(xì)胞群之間、同一實驗室中進(jìn)行的不同實驗之間、或來自不同實驗室的數(shù)據(jù)集之間。這里主要介紹第一種和最后一種情況：
看一下Combat矯正前后的差別：其中顏色表示不同樣本  圖7 去噪也是矯正的一種類型。單細(xì)胞數(shù)據(jù)的一個特點就是含有許多噪音來源，其中一個就是dropout。一些工具就用來推斷dropout，用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)量來替代0，例如：MAGIC、DCA、scVI、SAVER、scImpute。去噪可以提高基因間相關(guān)性的估計。這一步可以和歸一化、批次矯正及其他下游分析整合起來，例如基于Python的scVI工具。但任何方法都可能導(dǎo)致矯正過度或不足。 4.4.3 小結(jié)
4.5 挑選基因、降維、可視化人類的scRNA數(shù)據(jù)中可能會包含25000個基因，但其中許多基因并非能提供有用信息，還有很多基因表達(dá)量直接為0。即使在QC階段去掉這些表達(dá)量為0的基因，一個單細(xì)胞數(shù)據(jù)的基因空間依然會有超過15000個維度（一個基因表示一個維度），因此需要降低維度 4.5.1 首先挑選基因就是挑那些真正”具有情報價值“的基因，也就是會數(shù)據(jù)變化起作用的基因。因此我們這里會挑選名為HVG的基因，也就是highly variable genes。根據(jù)數(shù)據(jù)集的復(fù)雜程度不同，HVGs一般會有1000-5000個（如下圖就對不同數(shù)據(jù)集的HVGs做了個統(tǒng)計）  圖8 之前有研究表明，HVGs數(shù)量從200到2400，它們降維后的表現(xiàn)差不多（Klein et al (2015)，作者建議先盡量多選一些HVGs。 比較流行的挑選HVGs的方法有Scanpy和Seurat，而且最好是在去除技術(shù)因素后挑選，避免因為批次、測序等因素導(dǎo)致錯誤挑選HVG。當(dāng)然還有其他挑選的方法，看Yip et al (2018). 4.5.2 接著降維挑出來HVGs后，就是降維了，力求在最少的維度中捕捉到最多的數(shù)據(jù)特征。 常用的降維方法：A-F分別是：PCA、t-SNE、diffusion maps、UMAP、ForceAtlas2（force‐directed graph）、Variance explained by the first 31 principal components (PCs)。關(guān)于單細(xì)胞數(shù)據(jù)的降維方法，詳細(xì)可以看：Moon et al (2018)  圖9 其中兩個應(yīng)用比較廣的方法是：PCA（Pearson, 1901）和diffusion maps (Coifman et al, 2005) 【diffusion maps 于2015年在單細(xì)胞領(lǐng)域走紅 Haghverdi et al (2015) 】
4.5.3 最后可視化可視化一般使用非線性降維的方法。最常用的就是2008年提出的t-SNE（ t‐distributed stochastic neighbour embedding）。t-SNE的一個特性就是關(guān)注局部而忽視整體，因此帶來的一個影響就是：可視化結(jié)果可能夸大了細(xì)胞群之間的差異，忽略了這些細(xì)胞群之間的潛在聯(lián)系 另外，使用t-SNE的一大難點就是 除了t-SNE，還有2018年推出的UMAP和SPRING可以用，在缺乏明確的生物學(xué)問題時，可以用UMAP作為不錯的數(shù)據(jù)探索。 小結(jié)
4.6 「總結(jié)」 預(yù)處理的各個階段作者貼心將預(yù)處理比作5種類型數(shù)據(jù)的處理： 原始數(shù)據(jù)（raw data）、歸一化數(shù)據(jù)（normalized data）、矯正后的數(shù)據(jù)（corrected data）、挑選后的數(shù)據(jù)（feature‐selected data）、降維后的數(shù)據(jù)（dimensionality‐reduced data） 這5個階段又分成3個層次：
其中每個步驟適時調(diào)整，例如單一批次的數(shù)據(jù)集，就可以跳過矯正批次這一步  圖10 5 下游分析之細(xì)胞層面下游分析的目的是解釋生物問題，例如根據(jù)表達(dá)量將細(xì)胞劃分成不同的類型；相似細(xì)胞間表達(dá)量的微小變化也會體現(xiàn)連續(xù)的分化路徑；基因表達(dá)量之間的相關(guān)性可能與基因共表達(dá)有關(guān)... 下游分析也是有細(xì)胞層面和基因?qū)用妫?/p>
 圖11
5.1 細(xì)胞分群5.1.1 先是：分群方法
將細(xì)胞分群基本就是任何單細(xì)胞分析的必經(jīng)之路。群的劃分就是根據(jù)細(xì)胞中基因表達(dá)譜的相似性，表達(dá)譜的相似性是由于歐幾里得距離量度決定的，而距離量度又是利用的降維的數(shù)據(jù)。一般有兩種方法計算：clustering algorithms、community detection methods
5.1.2 然后是：分群后的注釋這個過程主要是基因?qū)用娴牟僮?，為每個cluster找marker gene（也就是能代表這個cluster的基因，而這個基因又和已知的細(xì)胞類型有關(guān)）。任何的分群算法和參數(shù)設(shè)置都會將一整團(tuán)細(xì)胞分成多個群，但這些群是否真的有意義，就要靠這一步來和生物背景結(jié)合起來。 我們希望看到的是存在很多類型的細(xì)胞，來說明細(xì)胞異質(zhì)性的問題，但這里關(guān)于細(xì)胞類型這個定義還是存在爭議。首先，細(xì)胞類型的劃分怎樣算是清楚，對于一些人來說，”T cells“這個名稱可以叫一個細(xì)胞類型，但還有人認(rèn)為，必須繼續(xù)深入，像”CD4+ T cells“、”CD8+ T cells“才叫細(xì)胞類型；另外，即使是同一種細(xì)胞類型的細(xì)胞也會有不同的發(fā)育狀態(tài)，因此它們也會顯示不同的分群結(jié)果。但不管如何，它們都是當(dāng)時細(xì)胞的一種身份（identity）
因此，我們將分群的結(jié)果稱為不同身份的細(xì)胞（cell identities）會比不同類型的細(xì)胞（cell types）要好一些【即每個亞群可能并不是真的不同類型細(xì)胞，只是顯示了此時此刻的細(xì)胞身份】 對于不同細(xì)胞身份的注釋，近年來也隨之細(xì)胞圖譜的研究而加速，例如小鼠腦細(xì)胞圖譜 (Zeisel et al, 2018) 、人類細(xì)胞圖譜 (Regev et al, 2017)的發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了許多參考數(shù)據(jù)庫。在缺乏相關(guān)背景的情況下，我們可以借用數(shù)據(jù)庫中已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞marker 基因套入我們的細(xì)胞，幫助判斷細(xì)胞身份。需要注意：通常使用的細(xì)胞表面marker基因在細(xì)胞身份鑒定方面存在局限性(Tabula Muris Consortium et al, 2018)
圖12
利用差異分析，分成兩組：某個cluster中的細(xì)胞、數(shù)據(jù)集中其余全部的細(xì)胞。然后重點關(guān)注這個cluster中上調(diào)的基因，因為marker基因一般具有更強(qiáng)的表達(dá)作用。差異分析也會使用簡單的統(tǒng)計檢驗，例如Wilcoxon rank‐sum test、t-test，將基因的差異大小排個序，選出排名靠前的基因來作為marker基因
將數(shù)據(jù)集中選出的marker基因和參考數(shù)據(jù)集進(jìn)行比對，統(tǒng)計方法可以是：enrichment tests、the Jaccard index、other overlap statistics 參考數(shù)據(jù)集可以是網(wǎng)頁工具： www.mousebrain.org、 http:///，可以將選出的marker基因在參考數(shù)據(jù)集中進(jìn)行可視化，幫助判斷這個marker基因是什么細(xì)胞身份
細(xì)胞分群、分群注釋、重分群、重注釋...這個循環(huán)很耗費(fèi)時間。自動化注釋方法加快了這個過程，例如scmap (Kiselev et al, 2018b) 、Garnett (preprint: Pliner et al, 2019) ，但這樣的方法有利有弊。自動化提高了速度，但相比手動注釋也降低了靈活性。畢竟自動化工具使用的參考數(shù)據(jù)集中可能并不包含我們數(shù)據(jù)中的這樣細(xì)胞。因此，有自動化工具也不能完全拋棄手動挑選，尤其針對大型數(shù)據(jù)集中多種多樣的細(xì)胞。自動化的過程可以先幫我們粗略地給細(xì)胞加個標(biāo)記，如果有需要，我們可以繼續(xù)手動對這種細(xì)胞繼續(xù)劃分子細(xì)胞。對于小型數(shù)據(jù)集或者缺乏參考基因集的，手動注釋就足夠了。 5.1.3 注意
5.1.4 細(xì)胞分群衍生——細(xì)胞組成分析（Compositional analysis）就像上面的圖12中的C圖，顯示的是近端(上圖)和遠(yuǎn)端(下圖)腸上皮區(qū)域的細(xì)胞身份組成圖（顏色越深細(xì)胞密度越大）。研究細(xì)胞組成的變化也是一個新方向，例如沙門氏菌感染已被證明會增加小鼠腸上皮細(xì)胞的比例 (Haber et al, 2017)。 這個分析既需要足夠多的細(xì)胞數(shù)量來推斷各個cluser的占比，又需要足夠的樣本數(shù)量來證明是單純一個樣本得cluster數(shù)量這樣變還是總體都會這樣變。相關(guān)的分析工具還沒有太多，未來的開發(fā)可能會借鑒單細(xì)胞質(zhì)譜流式（mass cytometry）或者是宏基因組分析【單細(xì)胞與宏基因組的結(jié)合...】 5.2 軌跡分析5.2.1 軌跡推斷Trajectory inference軌跡推斷就是為了找到不同細(xì)胞身份、分化或者生物過程中漸進(jìn)式非同步的變化，構(gòu)建出的一個動態(tài)模型。它認(rèn)為單細(xì)胞數(shù)據(jù)實際上就是一個連續(xù)過程中的快照（snapshot），這個過程可以通過在細(xì)胞空間中尋找最小化相鄰細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄變化的路徑來重建
圖13 2014年Monocle和Wanderlust先推出了軌跡推斷，之后誕生的分析方法更加豐富，它們在建模路徑的復(fù)雜性上有所不同，從簡單的linear or bifurcating(分叉) trajectories，到復(fù)雜的graphs, trees, or multifurcating(多叉) trajectories。Saelens et al, 2018)進(jìn)行過軌跡推斷方法的比較，結(jié)論是沒有一種方法對所有類型的軌跡推斷有效，應(yīng)該根據(jù)預(yù)期軌跡的復(fù)雜度來選擇。不過，Slingshot在簡單軌跡推斷中優(yōu)于其他方法(Street et al, 2018) 。如果期望得到更復(fù)雜的軌跡，PAGA值得推薦。軌跡推斷是一個不確定的過程，可以用多種方法來進(jìn)行佐證。
5.2.2 基因表達(dá)量的動態(tài)變化在擬時序（pseudotime）中變化的基因描述了軌跡，這組與軌跡相關(guān)的基因有望包含調(diào)控建模過程的基因，可以用來識別潛在的生物過程。 目前很少有專門分析基因表達(dá)動態(tài)變化的工具。BEAM將Monocle的軌跡推斷整合進(jìn)來，允許檢測在軌跡分支過程中相關(guān)基因的動態(tài)變化。另外還有LineagePulse (https://github.com/YosefLab/LineagePulse)考慮了dropout技術(shù)噪音但還在開發(fā)中。 下面這樣的圖在Slingshot的幫助文檔就有提及：https:///packages/release/bioc/vignettes/slingshot/inst/doc/vignette.html 【4.1：Identifying temporally expressed genes】 Slingshot基因表達(dá)量的動態(tài)變化 5.2.3 細(xì)胞亞穩(wěn)態(tài)分析 Metastable states
擬時序分析會展示出不同階段細(xì)胞數(shù)量的多少。假設(shè)細(xì)胞以無偏的方式采樣，其中軌跡中的稠密區(qū)域就表示轉(zhuǎn)錄時首選的方案。當(dāng)把軌跡理解為一條時間線時（例如在發(fā)育這個時間線），這些密集的區(qū)域可能代表細(xì)胞的亞穩(wěn)態(tài)，可以結(jié)合擬時間坐標(biāo)來繪制直方圖，找到這些亞穩(wěn)態(tài)【因此看到B圖中很多種狀態(tài)，但C中直方圖認(rèn)為這幾個密集的區(qū)域才屬于亞穩(wěn)態(tài)】 Metastable states 5.2.4 整合分群與軌跡分析
將分群的結(jié)果當(dāng)成節(jié)點（node），將軌跡當(dāng)成節(jié)點之間的橋梁（edge），所以將動靜數(shù)據(jù)結(jié)合在了一起。利用partition‐based graph abstraction（PAGA）這個工具就能得到類似下面這個圖。
整合分群與軌跡分析 6 下游分析之基因?qū)用?/h3>之前都是對細(xì)胞進(jìn)行分析，但細(xì)胞中的基因分析會提供更多的信息。例如差異表達(dá)分析、基因集分析和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷，不是表面上研究細(xì)胞異質(zhì)性，而是基于異質(zhì)性探索基因表達(dá)相關(guān)的原因 6.1 差異表達(dá)分析
這個方法也是常規(guī)bulk轉(zhuǎn)錄組中經(jīng)常做的。不過單細(xì)胞相比于bulk轉(zhuǎn)錄組的一個優(yōu)勢就是：可以深入一個層次，原來bulk只是看一塊組織的平均表達(dá)量，但現(xiàn)在經(jīng)過分群后，能得到一塊組織中各種各樣的亞群，再結(jié)合差異分析，對理解異質(zhì)性問題更有幫助。 雖然都是朝著一個方向前進(jìn)，但單細(xì)胞和bulk轉(zhuǎn)錄組的差異分析方法還是不同的。
但最近(Soneson & Robinson, 2018)研究表明，基于大批量的差異分析，bulk分析方法的性能與最好的單細(xì)胞分析方法相當(dāng)。當(dāng)bulk方法進(jìn)行改進(jìn)，加入基因權(quán)重分析后，表現(xiàn)要好于單細(xì)胞原有工具。例如：bulk差異分析工具DESeq2/EdgeR + ZINB‐wave工具估算的權(quán)重。 不過，bulk差異分析工具的性能雖然好，但是計算的效率很難提升。畢竟單細(xì)胞數(shù)據(jù)樣本數(shù)量越來越多，程序跑的時間長短也成了衡量工具優(yōu)劣的重要因素。單細(xì)胞工具MAST脫穎而出。在單個數(shù)據(jù)集的小范圍比較中，完勝bulk和其他單細(xì)胞方法(Vieth et al, 2017)。而且MAST比bulk方法快了10到100倍 (Van den Berge et al, 2018) 。 小結(jié)
6.2 基因集分析
例如差異分析我們往往能得到上千基因，為了比較方便解讀，一般會把有共同特性的基因歸為一組，然后檢查我們歸類的可靠性 【grouping the genes into sets based on shared characteristics and testing whether these characteristics are overrepresented in the candidate gene list.】 我們一般關(guān)注基因在生物過程（biological processes, BP）中的富集，可以使用MSigDB、GO、KEGG pathway、Reactome數(shù)據(jù)庫 另外，單細(xì)胞中的一個新進(jìn)展就是利用成對基因標(biāo)簽進(jìn)行配體受體分析（ ligand–receptor analysis）
配體-受體成對標(biāo)簽可以從：CellPhoneDB數(shù)據(jù)庫獲得，然后用來解釋cluster之間高表達(dá)基因的聯(lián)系 例如，利用celltalker 就可以做 Celltalker分析 6.3 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) gene regulatory network (GRN)
方法例如：SCONE、PIDC、SCENIC (Single-Cell rEgulatory Network Inference and Clustering)，但發(fā)展還不是很完善，推斷的調(diào)控關(guān)系不是很穩(wěn)定【謹(jǐn)慎使用】 7 分析平臺現(xiàn)在開發(fā)了很多平臺，整合了一套分析流程，有基于R的(McCarthy et al, 2017; Butler et al, 2018) ，python的 (Wolf et al, 2018)，本地的(Patel, 2018; preprint: Scholz et al, 2018) ，網(wǎng)頁版帶可視化的(Gardeux et al, 2017; Zhu et al, 2017) Seurat是使用最廣泛的，Scater在QC和預(yù)處理中表現(xiàn)優(yōu)異；除此以外，基于Python的scanpy也逐漸發(fā)展起來，它對于大量細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化方面表現(xiàn)不錯 如果不使用命令行，可視化界面也有，只不過用戶只能跑人家已經(jīng)寫好的腳本，操作靈活性不足。這樣的平臺更多的用處是在可視化探索上，例如Granatum、ASAP。未來 Human Cell Atlas（HCA）會在數(shù)據(jù)可視化探索上迅速發(fā)展： https://www./data-sharing 8 結(jié)語8.1 作者的結(jié)語作者把流程測試和說明都放在了：https://github.com/theislab/single-cell-tutorial 感興趣的可以跟著走一遍，比較一下不同的工具。作者希望這一篇能代表單細(xì)胞領(lǐng)域目前發(fā)展的一個最新動向。他也提到，新方法層出不窮，本文介紹的大量的方法是經(jīng)過實踐比較、驗證過的。目前可用的方法不管是運(yùn)行效率還是易用性可能都不如最新開發(fā)的方法，但要注意：新方法在未被大量驗證之前都需小心使用。而且新方法一般都是針對單個層面（比如降維、分群、軌跡推斷等），大體的分析流程基本固定了。 未來整合深度學(xué)習(xí)和單細(xì)胞多組學(xué)是兩個重要的發(fā)展方向，流程化運(yùn)行更是趨勢。 隨著文庫制備和測序技術(shù)的進(jìn)步，未來的單細(xì)胞平臺必將可以處理多種類型數(shù)據(jù)：DNA甲基化、蛋白豐度等等。 8.2 劉小澤的結(jié)語
三天的時間，基本每天都會花半天時間在閱讀這篇綜述上。從第一眼看到它的文章邏輯，就感覺：嗯是它，沒錯了！連午覺都不想睡了。 一開始想強(qiáng)迫自己看下去，沒想到，越看越精彩。尤其是將整個流程和自己的知識結(jié)合起來，就看得比較順暢。為了更加易讀，我在其中加了很多注釋，包括之前自己寫的一些推文和網(wǎng)上一些好的資源，可以幫助梳理知識點。 最后，希望看完本文對你有幫助??！ 歡迎關(guān)注我們的公眾號～_～ Welcome to our bioinfoplanet! |
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