1 用18s RNA作為RT-PCR的內(nèi)參，應(yīng)該和β-actin是一個(gè)道理，半定量的目的是要看總RNA中的目的基因mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參的目的是去除一些系統(tǒng)誤差。

2 有文獻(xiàn)做過比較，之所以18s RNA比β-actin好是因?yàn)樗控S富，且任何情況下穩(wěn)定存在，所以受外界調(diào)控影響小，半定量時(shí)背景更加穩(wěn)定

3 但是不同的是18s是rRNA，沒有A尾巴，所以選它作內(nèi)參時(shí)，l理論上總RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)不能用OligodT作反轉(zhuǎn)錄引物，用隨機(jī)引物或6聚體引物,OligodT轉(zhuǎn)錄出來的可都是mRNA啊！如果選β-actin就不存在這個(gè)問題，因?yàn)樗黰RNA，有A尾巴。

4 實(shí)際上,用18S rRNA做內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄RNA用Oligo dT,能夠擴(kuò)增出來時(shí),對(duì)結(jié)果也不要表示懷疑.因?yàn)槠胀l件下的反轉(zhuǎn)不會(huì)很純粹，mRNA的含量在總RNA中只占5%，反轉(zhuǎn)時(shí)不是僅有它被反轉(zhuǎn)錄，即使是rRNA也是可以部分反轉(zhuǎn)成CDNA的，要不分離純mRNA怎么要用試劑盒進(jìn)行進(jìn)行磁珠吸附呢。另外，沒有反轉(zhuǎn)的rRNA和tRNA如果沒用RNA酶處理也是可以存在很長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)完全降解的。這樣的18S rRNA做內(nèi)參是不合適的，它的表達(dá)會(huì)隋時(shí)間推移降低的。
你既然用18S rRNA做內(nèi)參，就必須讓其穩(wěn)定表達(dá)。這樣在反轉(zhuǎn)錄RNA時(shí)除用Oligo dT外，還要用18S反向引物，反轉(zhuǎn)錄后的CDNA最好還用RNA酶處理一下，再高溫滅活。