大家好~今天給大家?guī)硪黄[瘤免疫相關(guān)的6分+純生信文章。為什么選擇這篇文章帶給大家呢？因為范文不僅用了非常簡單的GraphPad Prism作圖軟件和GEPIA數(shù)據(jù)庫就完成了，并且最重要的是利用了TCGA、GEO以及CCLE三大數(shù)據(jù)庫分析并驗證，思路清晰，邏輯鏈條完整，最關(guān)鍵的臨床意義也相當(dāng)明確。這篇文章2020年3月發(fā)表在“Cancers”上，題名為“Metabolic Plasticity in Ovarian Cancer Stem Cells ”，全文共包含8個Figure和5個Table。接下來我們一起挖掘這篇“方法簡單，套路神仙”的純生信文章套路吧~

研究背景

本篇范文研究的疾病——卵巢癌(OvCa)是女性第五大常見癌癥。早期診斷為局限性疾病的婦女的五年生存率超過90%，但確診時為第三期或第四期時，生存率急劇下降。OvCa盡管最初對化療有反應(yīng)，但仍有近75%的患者出現(xiàn)化療抵抗性疾病復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)被認(rèn)為是由于次優(yōu)切除和殘留的具有化學(xué)抵抗性的腫瘤細胞的存在，它們具有獨特的適應(yīng)環(huán)境、代謝、免疫和藥理學(xué)提示的能力。

雖然腫瘤干細胞（CSC）克隆可能具有相同的遺傳特征，但越來越多的證據(jù)表明克隆內(nèi)存在顯著的異質(zhì)性?；罨腃SC亞群可以進行表型轉(zhuǎn)換，進入更增殖的上皮樣狀態(tài)，并伴有代謝向有氧糖酵解、氧合酶、脂肪酸氧化(FAO)和谷氨酰胺分解的轉(zhuǎn)變。

數(shù)據(jù)解構(gòu)

“聯(lián)”——分子相關(guān)性分析及互作關(guān)系驗證

作者選取了GEO數(shù)據(jù)庫的兩個包括卵巢癌的球狀體和其親本細胞的OCSC 數(shù)據(jù)集——GSE28799和GSE64999。

之前有小伙伴問到過關(guān)于如何篩選數(shù)據(jù)集，為什么通過原文中的關(guān)鍵詞總是找不到文中應(yīng)用的數(shù)據(jù)集呢？今天我來給大家解答一下。在一篇生信文章中，最重要的就是樣本信息。數(shù)據(jù)集千千萬，如何選擇是關(guān)鍵~

數(shù)據(jù)集的選擇

首先，我們要確定研究的科學(xué)問題。疾病一般不會變，都是各位的研究領(lǐng)域，如果發(fā)個1-2分的文章灌灌水，那么選擇與疾病相關(guān)的幾個包含正常樣本對照的數(shù)據(jù)集就可以了。那如果想沖一沖上三分五分，選擇數(shù)據(jù)集上我們就要花費很多的精力啦！成年人的世界就是付出的永遠比得到的多，磨刀不誤砍柴工，哈哈~言歸正傳，到底如何選擇呢？答案就是——大面積撒網(wǎng)，重點捕撈。重點又來啦！第一步，限定關(guān)鍵詞。小編這里建議大家不要過多使用限定詞，真的會錯過一萬年。我們的關(guān)鍵詞只要包含“Disease”、“normal”以及我們研究的特殊方向就可以了，比如疾病亞型、相關(guān)藥物、特定基因、位點突變等。隨后我們選擇“Homo sapiens”及“Expression profiling by array”，如下圖所示：

這也就回答了一開始的問題，為什么根據(jù)已發(fā)表文章中的關(guān)鍵詞檢索總是找不到源數(shù)據(jù)集呢？因為作者篩選數(shù)據(jù)集時就不是通過限定關(guān)鍵詞檢索到，極大可能是“挨個看、挨個試”。要想得到符合預(yù)期的數(shù)據(jù)，是需要用很多數(shù)據(jù)集進行分析和驗證的，只有結(jié)果有意義才能說得上是好的數(shù)據(jù)集。如果一定要只選擇兩到三個數(shù)據(jù)集就可以得到完美的數(shù)據(jù)，那可能真的要靠運氣咯~

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總之篩選GEO數(shù)據(jù)集的主要原則有以下幾點：

①多個數(shù)據(jù)集均圍繞所要研究的臨床問題展開，如樣本的分組、分層等保持一致；

②包含比例恰當(dāng)?shù)募膊颖竞驼颖咀鰧φ眨?/p>

③確定樣本類型（組織、細胞、外周血等），保證樣本同源；

④ 數(shù)據(jù)平臺很關(guān)鍵。如果條件允許，我們盡量選擇GPL570等芯片平臺，如果多個平臺則需要使用R語言去除批間差。

接下來我們進入正題：

第一步：OCSCs標(biāo)記之間的相關(guān)性

篩選到合適的數(shù)據(jù)集后，作者首先在轉(zhuǎn)錄水平上確定不同的OCSC標(biāo)記在患者腫瘤中是否相互關(guān)聯(lián)。這里使用了GEPIA 對TCGA中的樣本數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD44轉(zhuǎn)錄本與OCSCs的標(biāo)記物SOX2、NOTCH1、OCT4/POU5F1、ALDH1A1顯著相關(guān)，但與CD24、CD117/KIT、CD133/PROM1或NANOG不相關(guān)（Fig.1A）

隨后，為比較OCSCs和其親代細胞是否具有同樣的性質(zhì)，作者從GEO數(shù)據(jù)庫中選取了來自O(shè)VCAR3細胞系GSE28799和GSE64999，同樣進行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明與親代OVCAR3細胞相比，來自O(shè)VCAR3球型干細胞的CD44、CD24、CD117/KIT、CD133/PROM1、ALDH1A1和SOX2顯著上調(diào)。在OCT4 / POU5F1 NANOG上未發(fā)現(xiàn)明顯變化。對GSE64999數(shù)據(jù)集的進一步分析證實，ALDH1A1和SOX2顯著上調(diào)，但其他假定的OCSCs的標(biāo)記沒有上調(diào)(Fig.2B)。

Ps:這里介紹一下GSE64999數(shù)據(jù)集鑒定了在卵巢癌干細胞在成球條件下進行體外培養(yǎng)的分化過程中受調(diào)控的基因表達譜分析。GSE28799數(shù)據(jù)集包括3份親代OVCAR-3細胞的復(fù)制培養(yǎng)物和3份干細胞樣球狀細胞衍生的培養(yǎng)物。證明球狀細胞（SDC）與親代OVCAR-3細胞相比，具有自我更新的潛力，SDCs還顯示出更高的侵襲性，遷移潛力以及對標(biāo)準(zhǔn)抗癌劑的增強抗性。可見作者選取的數(shù)據(jù)集真的是別有一番用心~首先這兩組細胞系類型基本一致，均為OCSCs及其親本細胞，并且GSE64999包含未分化和分化的球狀體；研究的臨床問題也一致。可以想象為了找這兩個驗證數(shù)據(jù)集，作者團隊也是煞費苦心了。總之，選擇數(shù)據(jù)集是關(guān)鍵，這決定了我們后續(xù)以何種變量進行分組，可以做什么樣的分析。

第二步：——構(gòu)建分子交互網(wǎng)絡(luò)

STRING protein-protein interaction web工具對這些OCSC標(biāo)記的相互作用進行建模，基于NOTCH1、SOX2、OCT4、NANOG、CD117和CD133之間具有實驗證據(jù)支持的互作關(guān)系預(yù)測;發(fā)現(xiàn)CD44與耐藥標(biāo)記物ABCB5相關(guān)（Fig.1B）。

“靠&圈”——功能富集以及臨床變量相關(guān)性分析

靠

為了研究這些具有相關(guān)行的細胞標(biāo)記與臨床問題是否有聯(lián)系，作者為此分析了：

① CD44的轉(zhuǎn)錄本與糖酵解標(biāo)記之間存在正相關(guān)；

② TCGA數(shù)據(jù)庫中分析NOTCH1、CD133、CD44、CD24和ALDH1A1與三羧酸循環(huán)(TCA)酶顯著正相關(guān)；

③ 卵巢癌干細胞中的OXPHOS與OCSCs表面標(biāo)志物間的相關(guān)性分析；

④ OVCAR3-OCSCs在CD36、ACACA、SCD和CPT1A中也顯著升高，CD44、CD133和ALDH1A1與脂質(zhì)代謝酶呈正相關(guān)；

⑤ TCGA數(shù)據(jù)庫中OCSC標(biāo)記物與谷氨酰胺代謝酶之間存在正相關(guān)。

圈

并且在“圈”——功能聚類這一層面與其他生信分析中分子的GO/KEGG/GSEA富集分析不同的是，該研究通過細胞表面標(biāo)記與相互作用的各種酶和復(fù)合物的標(biāo)記進行富集分析，將分子間的互作關(guān)系與臨床表型相聯(lián)系。

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OCSCs標(biāo)記與糖酵解的相關(guān)性

作者首先比較了參與糖酵解的酶在OCSCs及其親本細胞中GSE28799和GSE64999的表達情況。發(fā)現(xiàn)與親本OVCAR3細胞相比，在OVCAR3球樣來源的OCSCs中，葡萄糖轉(zhuǎn)運體SLC2A1、己糖激酶1 (HK1)和丙酮酸脫氫酶激酶1 (PDK1)顯著上調(diào)(Fig.3A)。而在GSE64999中未分化和分化的球狀體的糖酵解酶沒有顯著差異(Fig.3B)。到此，作者已分析得到與親本OVCAR3相比，OVCAR3-球狀體的OCSC標(biāo)記物和糖酵解酶總體呈正相關(guān)趨勢。CD44、CD24與HK1、PGK1呈顯著正相關(guān)。NOTCH1與HK2呈顯著正相關(guān)。其他標(biāo)記均與葡萄糖轉(zhuǎn)運體或糖酵解無顯著正相關(guān)。在GSE64999未分化的球狀體中，OCSC標(biāo)記同樣沒有表現(xiàn)出糖酵解的富集。CD44與SLC2A6呈正相關(guān)，CD24與PHGDH呈負(fù)相關(guān)。NOTCH1與糖酵解酶或糖酵解沒有任何顯著的相關(guān)性(Fig.3C-D)。

隨后作者利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析病人的腫瘤,發(fā)現(xiàn)CD44、NOTCH1的表達和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白及糖酵解酶表現(xiàn)出正相關(guān)性(Fig.3e和Table 1)。

▲ Fig.3 GSE28799和GSE64999中糖酵解標(biāo)志物的表達。

▲ Table 1.在TCGA和GEPIA誘導(dǎo)的卵巢癌標(biāo)本中，CSC轉(zhuǎn)錄本的表達與葡萄糖轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)錄本以及參與糖酵解的關(guān)鍵酶之間的Pearson相關(guān)性研究。紅色表示顯著正相關(guān)，藍色表示顯著負(fù)相關(guān)。

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OCSCs標(biāo)記物與三羧酸（TCA）循環(huán)的相關(guān)性

我們都知道TCA循環(huán)是多種分解代謝和合成代謝途徑整合的樞紐，其中就包括了糖酵解、糖異生、線粒體電子傳遞鏈、脂肪酸和膽固醇合成以及谷氨酰胺代謝。

于是作者分析了在GSE28799數(shù)據(jù)集中，TCA循環(huán)酶在OVCAR3干細胞及其親本對照中的表達情況。發(fā)現(xiàn)烏頭酸酶1 (ACO1)、異檸檬酸脫氫酶(IDH1)、IDH3A、琥珀酸-輔酶a連接酶(SUCLG2)和蘋果酸脫氫酶2 (MDH2)顯著上調(diào)，而蘋果酸酶2 (ME2)顯著下調(diào)(Fig.4A)。在GSE64999中，分化和未分化的OCSCs的TCA循環(huán)酶的轉(zhuǎn)錄本沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(Fig.4B)。在GSE28799中，ovcar3干細胞中酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和OCSC標(biāo)記的表達存在相關(guān)性，與TCA酶呈正相關(guān)趨勢。NANOG與10種酶呈正相關(guān)，且僅與CS顯著相關(guān)。ALDH1A1與9種酶呈顯著正相關(guān)。CD117/KIT與6種酶正相關(guān)，且僅與IDH2和MDH2顯著。其他因素表現(xiàn)為積極，但不顯著與TCA酶的關(guān)系。CD44和CD24表現(xiàn)出相似的5個正相關(guān)模式和6個負(fù)相關(guān)模式，與ME2呈顯著負(fù)相關(guān)。而CD133與IDH3B、SOX2與IDH2呈顯著負(fù)相關(guān)。POU5F1/OCT4和NOTCH1與關(guān)鍵TCA酶均無顯著相關(guān)性(Fig.4C)。在GSE64999中，未分化和分化的球狀體中CSC轉(zhuǎn)錄本與TCA轉(zhuǎn)錄本的表達呈更負(fù)的趨勢。之后作者對每個有意義的分子標(biāo)志進行相關(guān)性分析(Fig.4D)。通過對TCGA數(shù)據(jù)集中OCSCs標(biāo)記與TCA酶的分析和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)NOTCH1與所有TCA酶呈正相關(guān)，與除SUCLG1/2外的所有酶均有顯著相關(guān)性(Fig.4E)。

▲ Fig.2 TCGA中OCSC標(biāo)記與TCA酶的相關(guān)性研究。

▲ Fig.4 OCSC模型中TCA標(biāo)記的表達

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卵巢癌干細胞中的OXPHOS

在葡萄糖饑餓狀態(tài)下，這些OCSCs處于完全靜止?fàn)顟B(tài)，并下調(diào)大多數(shù)代謝活動，同時維持OXPHOS結(jié)構(gòu)。CSCs可能表現(xiàn)出高度的糖酵解或OXPHOS表型，表型之間的代謝轉(zhuǎn)換具有可塑性，這不僅取決于癌癥類型和環(huán)境線索，還取決于葡萄糖饑餓或OXPHOS封鎖。由此，作者進一步研究了卵巢癌干細胞中的OXPHOS與OCSCs表面標(biāo)志物間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)OVCAR3-OCSCs(源自成熟的上皮卵巢癌細胞系的癌癥干細胞)主要在復(fù)合物I、III、IV和V中顯示了電子傳遞鏈的富集，進一步支持了對氧化磷酸化(OXPHOS)表型的依賴（Fig.5）。同時，作者還利用CCLE數(shù)據(jù)庫，證實了OCSC的標(biāo)記CD44、POU5F1/OCT4和NOTCH1的轉(zhuǎn)錄本表達呈顯著的負(fù)相關(guān)。

▲ Fig.5 電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物在GSE28799和GSE64999中的表達

并且還發(fā)現(xiàn)OCSC表面標(biāo)記之間的相關(guān)性和關(guān)鍵酶在兩個GEO數(shù)據(jù)集的OVCAR3-OCSCs模型中存在正相關(guān)性的趨勢,其中NANOG與ALDH1A1表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。然而，OCSC標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄量與復(fù)合物II、III、IV和V的轉(zhuǎn)錄量之間存在不一致的正負(fù)相關(guān)性，CD24和CD44與復(fù)合II酶呈陽性但不顯著的相關(guān)性(Fig.6A-B)。并在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗證了腫瘤患者的OCSC標(biāo)記物與酶的轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)性模式(Fig.6C和Table 3)

▲ Table 3 TCGA數(shù)據(jù)庫中CSC轉(zhuǎn)錄本的表達與ETC中涉及的關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄本之間的Pearson相關(guān)性

▲ Fig.6 OCSC標(biāo)記和其他復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄的相關(guān)性

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OCSC標(biāo)記物與脂代謝的關(guān)系

脂質(zhì)代謝在本質(zhì)上與葡萄糖和氨基酸代謝途徑結(jié)合，以滿足CSCs日益增長的生物能量需求。因此，脂類相關(guān)通路對CSCs的維持至關(guān)重要。于是作者分析了兩個GEO數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與親本OVCAR3相比,OVCAR3-OCSCs中CD36、ACACA表現(xiàn)出顯著增加。未分化與分化的OCSC模型的轉(zhuǎn)錄本分析顯示SCD在未分化OCSCs中呈上升趨勢(Fig.7A-B)。隨后作者又分析了OCSC標(biāo)記與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白和酶的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)NOTCH1、NANOG、OCT4、ALDH1A1和CD117與脂質(zhì)代謝標(biāo)記的相關(guān)性高于CD44、CD24、CD133或SOX2。CD44、CD24與脂肪酸結(jié)合蛋白4 (FABP4)呈顯著負(fù)相關(guān)。OCT4與CD36呈顯著正相關(guān)，與ACACA呈負(fù)相關(guān)。NANOG與ACACA呈負(fù)相關(guān)(Fig.7C-D)。這些數(shù)據(jù)表明OCSC表型的獲得與脂質(zhì)代謝特征的富集有關(guān)，因而進一步支持OCSCs獨特的代謝表型和“代謝可塑性”。這可能解釋了OCSCs在脂肪豐富的腹膜TME中存活的能力，導(dǎo)致最佳或次最佳手術(shù)和化療后復(fù)發(fā)。

▲ Table 4 TCGA中OCSC標(biāo)記物與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體及脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的相關(guān)性研究

▲ Fig.7 脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)運蛋白和酶在OCSC模型中的表達

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谷氨酰胺代謝提供氨基酸、核苷酸和脂質(zhì)生物合成所必需的碳和氨基氮。谷氨酰胺分解是一種合成代謝過程，可促進低能大分子的產(chǎn)生。有研究表明，OCSCs也利用谷氨酰胺代謝來治療耐藥，谷氨酰胺分解與OvCa患者較差的生存率顯著相關(guān)。為了探究OCSCs與谷氨酰胺代謝這一表型的相關(guān)性，作者又找到了谷氨酰胺代謝相關(guān)酶。通過分析GSE28799中OCSCs及其親本細胞中谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的表達，發(fā)現(xiàn)OVCAR3球樣來源的OCSCs中谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體SLC1A1和GLS的表達顯著上調(diào)(Fig.8A)。相比之下，GSE64999中未分化和分化的球狀體的谷氨酰胺代謝酶無顯著差異(Fig.8B)。隨后又比較了分子間的相關(guān)性(Fig.8C-E)。并在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗證OCSC標(biāo)記和谷氨酰胺代謝酶之間的正相關(guān)性（Table 5）,在CCLE數(shù)據(jù)庫及GEO數(shù)據(jù)集的實驗?zāi)Ｐ椭序炞C谷氨酰胺代謝對OCSCs和OvCa細胞生長而言是必不可少的。

▲ Table 5 TCGA中OCSC標(biāo)記與谷氨酸轉(zhuǎn)運體及谷氨酸/谷氨酰胺代謝關(guān)鍵酶的相關(guān)性研究

▲ Fig.8 谷氨酰胺/谷氨酸代謝轉(zhuǎn)運蛋白和酶在OCSC模型中的表達

全文總結(jié)

本篇范文的圖表形式并不算很豐富，但選題創(chuàng)新點，臨床相關(guān)性強，研究的臨床問題豐富，論述充分。以化療耐藥為主要臨床問題，論述殘留的癌癥干細胞(CSCs)具有適應(yīng)幾種代謝和信號通路的功能，這是今后開發(fā)新的靶向治療的主要挑戰(zhàn)。作者在轉(zhuǎn)錄水平上確定不同的OCSC標(biāo)記在腫瘤中的相關(guān)性，并通過構(gòu)建分子的PPI網(wǎng)絡(luò)模型，根據(jù)實驗證據(jù)預(yù)測互作關(guān)系，分析挖掘OCSC標(biāo)記與耐藥標(biāo)記物間的相關(guān)性。

再來看看文章種用到的數(shù)據(jù)來源

①基因表達譜：選取同時包括了卵巢癌的球狀體和母細胞的GSE28799和GSE64999兩個數(shù)據(jù)集；

②OvCa細胞系數(shù)據(jù)：來自Broad Institute Cancer cell Line Encyclopedia (CCLE)網(wǎng)絡(luò)平臺，并進行了類似的分析。

本篇范文重點在于各種相關(guān)性分析，利用的分析方法和工具：

① 采用Holm-Sidak多重t檢驗分析OCSCs及其親代細胞中標(biāo)記物及代謝途徑中涉及的酶的差異表達，皮爾遜相關(guān)分析法分析對不同群體的OCSC標(biāo)記與代謝酶轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)性，均采用GraphPad Prism 7.0進行；

② 通過GEPIA進行TCGA數(shù)據(jù)庫種基因間相關(guān)性分析，利用Excel制作相關(guān)性條形圖。

兩個數(shù)據(jù)集不僅可以相互佐證，并且在GSE64999還包含了未分化與分化的球形細胞，能夠用于亞組分析。多個數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合使用不僅分析了細胞標(biāo)記間的相關(guān)性、臨床意義及功能聚類。更加巧妙的驗證了在不同數(shù)據(jù)庫的細胞模型中，這些分子標(biāo)記間的相關(guān)性，且在模型系統(tǒng)之間存在差異。最后作者將數(shù)據(jù)模型系統(tǒng)與患者標(biāo)本進行適當(dāng)?shù)恼虾万炞C，這不僅可以彌補在OCSCs代謝編程方面的知識空白，而且有助于設(shè)計針對休眠、耐藥和CSCs代謝可塑性的新策略。全文思路清晰，邏輯鏈完整，值得我們深入學(xué)習(xí)！最后還是要感慨一下，分子間的相關(guān)性與臨床變量或者表型融合到一起，真的是體現(xiàn)創(chuàng)新性的絕佳套路~

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