Identifying Key Genes and Functionally Enriched Pathways in Sj?gren’s Syndrome by Weighted Gene Co-Expression Network Analysis

通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定干燥綜合征的核心基因與功能通路富集

一、研究背景

干燥綜合征（SS）是一個主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫病，以口干和眼睛干燥為主要癥狀，并可伴有多器官系統(tǒng)性表現(xiàn)。目前SS的病因與確切分子機(jī)制尚不明確，一些miRNA可以作為SS的診斷標(biāo)志物，作者希望通過較大樣本的WGCNA分析識別SS相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)特征，確定具有診斷意義的核心基因。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1.篩選SS組和正常對照組的差異表達(dá)基因

GSE51092中的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集包含190例SS患者和32例健康對照組外周血樣本，使用limma包進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，以SAM篩選|log2FC| ≥1和FDR <0.05的DEGs，結(jié)果選出1,483個DEGs，表1展示了差異表達(dá)最明顯的20個上調(diào)基因和10個下調(diào)基因。

2.WGCNA分析樣本中基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

• 確定合適的soft-thresholding power（軟閥值）建立臨近矩陣以使基因分布符合無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)特征，圖A中對1到20的軟閥值進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，左圖縱坐標(biāo)為無標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)，以0.9作為閾值，右圖為平均連接度，結(jié)果確定8作為軟閥值。

• 對基因進(jìn)行聚類分析，對聚類樹以動態(tài)剪切法最終得到17個共表達(dá)模塊（圖B），其中藍(lán)綠色模塊中包含的基因最多，其次是黑色、藍(lán)色和黃色。

• 圖C中拓?fù)渲丿B熱圖顯示上述模塊之間的高度獨立性。

3.模塊-特征相關(guān)性分析和hub基因鑒定

模塊-特征相關(guān)性熱圖（圖A）和各模塊的基因顯著性值（圖B）顯示多個模塊與SS相關(guān)，其中藍(lán)綠色模塊與SS相關(guān)性最高。圖C顯示藍(lán)綠色模塊中 module membership（MM）與基因顯著性之間的相關(guān)性，以基因顯著性>0.4且MM較高（加權(quán)相關(guān)指數(shù)>0.9)為標(biāo)準(zhǔn)，將前19個基因確定為hub基因，圖D中展示了這19個基因的拓?fù)渲丿B熱圖，顯示出基因之間的高正相關(guān)。

4.核心共表達(dá)模塊的功能注釋

作者對藍(lán)綠色模塊中的基因進(jìn)行了GO富集分析，結(jié)果顯示基因主要富集在對病毒的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、對細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生物過程（圖A）。Circos圖對基因與GO terms的關(guān)系進(jìn)行交叉驗證，顯示其中大量與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因也同時富集在其他生物過程中，表明這些基因可能與協(xié)調(diào)SS發(fā)展的多種生物途徑有關(guān)。

5.hub基因的驗證與功效評估

作者對WGCNA鑒定的hub基因中沒有SS相關(guān)研究的5個基因進(jìn)行了表達(dá)差異的驗證與功效評估：EIF2AK2 (A)，GBP1 (B)，PARP12 (C)，TDRD7 (D)，PARP14 (E)。圖4為原數(shù)據(jù)集，圖5圖6中作者使用GSE84844（30例SS患者與30例對照組外周血單核細(xì)胞的表達(dá)譜數(shù)據(jù)）和GSE66795（131例SS患者與30例健康對照組外周血表達(dá)譜數(shù)據(jù)）兩數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示以上5個基因表達(dá)量在SS患者中均顯著上調(diào)(P < 0.001)。

圖7中作者以ROC曲線評估了5個基因的診斷價值，結(jié)果顯示在3個數(shù)據(jù)集中5個基因的AUC值均大于0.7，表現(xiàn)出較高的診斷價值。

6.hub基因的單基因GSEA分析

• 作者分別以5個hub基因的表達(dá)量中值將樣本分為兩組進(jìn)行GSEA分析，以MSigDB中的h.all.v6.2.sytmbols.gmt作為參考基因集。圖8展示了5個hub基因分組中差異表達(dá)基因的富集結(jié)果氣泡圖，作者從中選出與免疫相關(guān)的基因集進(jìn)行進(jìn)一步分析。

• 結(jié)果顯示EIF2AK2（圖9A）和TDRD7（圖9E）高表達(dá)組中“inflammatory response”、 “interferon α response”和 “interferon γ response三個基因集顯著富集。GBP1高表達(dá)組中“Regulation of the immune response”、“Regulation of the defense response” 和 “response to cytokine”三個基因集顯著富集（圖9B）。PARP12（圖9C）和PARP14（圖9D）高表達(dá)組中“inflammatory response” 和 “interferon α response”兩個基因集顯著富集。