by 菜泡飯

原文鏈接：

https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC5934679/

知識點積累

1. m6A作為mRNA的普遍的修飾，在含有METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶時mRNA前體轉(zhuǎn)錄后立即發(fā)生m6A甲基化;而FTO和ALKBH5負責m6A去甲基化。 通過甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶之間的相互作用，m6A水平保持平衡，形成m6A結合蛋白的對接位點和RNA二級結構的適當組裝。具有足夠的m6A水平的mRNA轉(zhuǎn)錄物可被適當剪接，轉(zhuǎn)運，翻譯或降解。隨著m6A測序技術的發(fā)展和成熟，目前發(fā)現(xiàn)在非編碼RNA如lincRNA，miRNA，circRNA等中均存在m6A修飾，然而在非編碼RNA中m6A修飾的功能尚未被完全探索，給予研究者廣大的研究空間。

2. LincRNA：位于編碼蛋白的基因之間，其中長度超過200nt的非編碼RNA。目前對其的功能研究主要為以下幾個方面1、轉(zhuǎn)錄干擾；2、誘導染色質(zhì)重構和核小體修飾；3、調(diào)控可變剪接模式；4、產(chǎn)生內(nèi)源siRNAs；5、調(diào)控蛋白質(zhì)的活性；6、結構或組織功能；7、改變蛋白質(zhì)的定位；8、小RNA的前體等。

3. ce RNA：competing endogenous RNAs,內(nèi)源競爭RNA。已知microRNA可以通過結合mRNA導致基因沉默，而ceRNA可以通過競爭性地結合microRNA來調(diào)節(jié)基因表達。ceRNA可以通過應答元件（microRNAresponse elements，MREs)與microRNA結合從而影響microRNA導致的基因上調(diào)，這揭示了一條RNA->microRNA調(diào)節(jié)通路的存在，具有重大生物意義。

實驗結果

為了研究lincRNA 1281在鼠源性胚胎干細胞中的功能，首先作者用RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)抑制小鼠胚胎干細胞分化可明顯下調(diào)lincRNA1281的表達。又用RNA FISH實驗明確了lincRNA1281在細胞中的定位（胞質(zhì)），為后續(xù)研究lincRNA 1281的功能在提供位置上的引導。那么敲低lincRNA1281對胚胎干細胞到底有怎樣的影響呢？作者用shlincRNA1281的細胞做了一系列表型實驗。發(fā)現(xiàn)敲除lincRNA 1281對胚胎干細胞的再生能力并沒有影響，主要體現(xiàn)在一些再生能力指標沒有什么變化。而敲除lincRNA1281后，胚胎干細胞的分化能力顯著下降，主要表現(xiàn)在體內(nèi)實驗的畸胎瘤體積和重量減小，畸胎瘤的一些列分化指標的下降。以上提示linc RNA1281對小鼠胚胎干細胞的分化潛能至關重要，且為促進作用。

2.linc RNA 1281存在m6A修飾且與lincRNA 1281在鼠胚胎干細胞中的作用正相關

以往文獻提示在胚胎干細胞分化過程中，m6A發(fā)揮相當重要的作用，且非編碼的lincRNA的m6A修飾也已有報道。作者想要了解在鼠源胚胎干細胞中，lincRNA是否存在m6A修飾以及發(fā)生m6A修飾的linc RNA 1281發(fā)揮著怎么樣的作用。首先作者通過MeRIP實驗證明linc RNA1281存在m6A修飾，且敲低mettl3后lincRNA 1281本身表達并未受到影響而lincRNA 1281上的m6A修飾顯著下降。那么lincRNA 1281的m6A修飾位點具體在哪里呢？根據(jù)linc RNA1281的m6A修飾預測結構，作者做了一些列的突變實驗，發(fā)現(xiàn)A916,1024 and 1054-G這三個都是m6A的修飾位點。那么m6A修飾對lincRNA 1281在鼠胚胎干細胞中的作用又有什么樣的影響呢？于是作者做了一些列常規(guī)敲除和rescure實驗，發(fā)現(xiàn)A-G突變的lincRNA 1281即不存在m6A修飾的linc RNA 1281無法rescure敲除linc RNA1281對鼠胚胎干細胞分化能力的影響。即linc RNA 1281的m6A修飾可促進鼠胚胎干細胞的分化。

既然前文已經(jīng)提到linc RNA 1281在鼠胚胎干細胞中促進其分化，那么它是如何起到促進分化的作用的呢? 根據(jù)linc RNA 1281的在胞質(zhì)中的定位以及目前了解到的其常規(guī)功能，作者猜想其是否可作為一個ce RNA來發(fā)揮其作用。那么lincRNA1281又是作為誰的ce RNA？目前我們比較常見的模式是lncRNA-miRNA-mRNA，因此作者猜想lincRNA 可能作為與胚胎干細胞分化能力有關的miRNA的ceRNA從而影響miRNA 與目的功能基因的結合。通過文獻搜索發(fā)現(xiàn)let-7/lin28是與胚胎干細胞分化能力這個表型密切相關的經(jīng)典miRNA-mRNA軸，于是作者猜想lincRNA 1281可否作為let-7家族的ceRNA。那么要驗證這個實驗目的，我們常規(guī)的實驗技術即luciference 雙熒光素報告基因?qū)嶒灆z測let-7家族的miRNA是否的確能與lincRNA 1281結合。于是構建包含linc 1281全長的報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)let-7家族的miRNA都能與linc RNA 1281結合，且結合位點分別為425-431以及965-971，這與let-7家族的具體成員有關。既然要證明兩者結合，除了用miRNA 去結合lincRNA 檢測熒光素活性外，反向即可用linc RNA 和結合蛋白復合體去拉miRNA 結果RIP實驗證明的確兩者存在相互結合。而且敲除lincRNA1281后，由于與lincRNA結合的miRNA 減少，因此游離出來用RT-PCR可檢測的miRNA 增加，對目的基因lin28的抑制作用也增加。

那么m6A在lincRNA1281充當ceRNA中發(fā)揮什么作用呢？作者發(fā)現(xiàn)當敲除mettl3或者突變lincRNA 1281的m6A修飾位點后，再做luciference實驗，發(fā)現(xiàn)lincRNA 1281和let-7家族的結合能力下降。經(jīng)典套路，即敲除和recure。

為了進一步研究這個ceRNA model是否介導lincRNA1281調(diào)節(jié)的鼠源性胚胎干細胞分化能力，作者敲除lincRNA 1281后過表達let-7 miRNA的sponge，即與miRNA結合的linc RNA 1281，發(fā)現(xiàn)該實驗可以有效的逆轉(zhuǎn)lincRNA 1281敲除對分化能力的抑制作用。一系列的表型實驗即當過表達let-7 sponge后，敲除lincRNA1281的胚胎干細胞的分化能力增強。當然作者也在補充材料里證明let-7/lin28 軸在胚胎干細胞分化能力中的重要作用。由于先前實驗已有報道，故在此論文研究中屬于驗證性結果放在補充材料中。

本文主要講了一個lincRNA 1281對胚胎干細胞分化能力起到促進作用的故事。

What：lincRNA 1281對胚胎干細胞分化能力起到促進作用

Why：為什么lincRNA 1281可以促進胚胎干細胞分化能力？作者解釋是因為lincRNA 1281發(fā)生了m6A修飾

How：發(fā)生m6A修飾的lincRNA1281是如何促進胚胎干細胞分化能力？作者又設想了一個ceRNA 的model，并進行了實驗證實。m6A修飾促進linc RNA 1281與miRNA let-7家族結合sponge，那么游離態(tài)的let-7家族數(shù)量就下降，與mRNA lin28（let-7的經(jīng)典底物）的結合就減少，lin28的轉(zhuǎn)錄后抑制減少，蛋白表達增加，而lin28是一個前人實驗證實的經(jīng)典的促進胚胎干細胞分化的因子。

這是我看的第一篇關于ceRNA的文章，而且又與lincRNA 的m6A修飾有關。LincRNA-miRNA-mRNA套路近幾年比較火熱，在轉(zhuǎn)錄后修飾領域研究較為深入，作者又巧妙地將非編碼RNA的m6A修飾引入這套系統(tǒng)里，將兩者結合的非常好。雖然文章的實驗手段都是比較基礎，但都很經(jīng)典很solid地解釋了問題，非常扎實。無論是非編碼RNA的m6A修飾（結合的RIP實驗還是找位點的一些列突變后的RIP實驗），還是ceRNA基本的套路（lincRNA-miRNA結合實驗）都做得很扎實，rescure實驗很完美。兩者結合又很有新意，我覺得沒有什么缺點，我很喜歡，值得學習。