癲癇，俗稱“羊角風(fēng)”或“羊癲風(fēng)”，是一種由腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電引起的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，國內(nèi)癲癇的總體患病率為7.0‰，年發(fā)病率為28.8/10萬，1年內(nèi)有發(fā)作的活動(dòng)性癲癇患病率為4.6‰。目前，在中國癲癇已經(jīng)成為神經(jīng)科僅次于頭痛的第二大常見病。

其中，顳葉癲癇的治療尤其具有挑戰(zhàn)性。其一，機(jī)體對(duì)抗癲癇藥物的耐藥性很高[1]。其二，外科切除顳葉中的癲癇灶可能仍然無法緩解癲癇癥狀[2]。因此，若要解決顳葉癲癇這一大難題，我們需解析大腦中參與并調(diào)控顳葉癲癇的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。正所謂孫子兵法有云:“知己知彼,百戰(zhàn)不殆。”

臨床研究表明，顳葉癲癇患者的黑質(zhì)（SN）體積相對(duì)較小，其中鐵離子含量也相對(duì)偏低[3, 4]。神經(jīng)生物學(xué)研究表明，在癲癇模型大鼠中，黑質(zhì)網(wǎng)狀部（SNr）的結(jié)構(gòu)與功能均發(fā)生改變[5-7]。此外，靶向SNr的損毀、藥物干擾或深部腦刺激均會(huì)調(diào)控癲癇發(fā)作的強(qiáng)度[8-10]。然而，對(duì)于SNr中參與顳葉癲癇的細(xì)胞類型及其環(huán)路機(jī)制，尚未可知。

2020年2月17日，《Nature Communications》雜志在線刊登了浙江大學(xué)陳忠教授的最新重要工作[11]，他們發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)網(wǎng)狀部小清蛋白陽性（PV）神經(jīng)元與丘腦束旁核神經(jīng)元參與并調(diào)控顳葉癲癇。本篇文章首次揭示黑質(zhì)網(wǎng)狀部調(diào)控顳葉癲癇的神經(jīng)元亞群及其環(huán)路機(jī)制，極大提高了人們?cè)诎d癇領(lǐng)域的認(rèn)知。

首先，為探究SNr PV神經(jīng)元是否參與顳葉癲癇過程，作者引入鈣信號(hào)光纖記錄方法。他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr中注射AAV-DIO-GCaMP6m，并植入光纖（圖1a）。他們發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的局灶性癲癇與全面性癲癇模型小鼠中，同側(cè)SNr PV神經(jīng)元的活性顯著增加（圖1b），表明SNr PV神經(jīng)元參與顳葉癲癇過程。

接著，為探究SNr PV神經(jīng)元在顳葉癲癇過程中的功能，作者引入光遺傳學(xué)神經(jīng)元操控方法。他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2-mCherry，植入光電極以驗(yàn)證ChR2陽性神經(jīng)元可被藍(lán)光而非黃光激活（圖2c-e）。他們發(fā)現(xiàn)，光激活SNr PV神經(jīng)元加速了顳葉癲癇發(fā)作階段，延長了后放電持續(xù)時(shí)間，易化了顳葉癲癇的誘導(dǎo)過程（圖2f-h）。此外，光激活此類神經(jīng)元增加了顳葉癲癇過程中小鼠的腦電指數(shù)（圖2i-j）。以上結(jié)果表明，SNr PV神經(jīng)元在海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程中起促進(jìn)作用。

圖2 光激活SNr PV神經(jīng)元促進(jìn)海馬

點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程

然后，作者進(jìn)一步探究生理狀態(tài)下SNr PV神經(jīng)元在海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程中是否具有必要性。他們?cè)俅我牍膺z傳學(xué)，他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ArchT，植入光電級(jí)以驗(yàn)證ArchT陽性神經(jīng)元可被黃光而非藍(lán)光抑制（圖3a-c）。他們發(fā)現(xiàn)，光抑制SNr PV神經(jīng)元延緩了顳葉癲癇發(fā)作階段，縮短了后放電持續(xù)時(shí)間，弱化了顳葉癲癇的誘導(dǎo)過程，而不改變后放電閾（圖3d-g）。此外，光抑制此類神經(jīng)元降低了顳葉癲癇過程中小鼠的腦電指數(shù)（圖3h-i）。

圖3  光抑制SNr PV神經(jīng)元延緩海馬

點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程

接著，作者探究生理狀態(tài)下SNr PV神經(jīng)元在其它顳葉癲癇模型中是否同樣具有必要性。他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-hM4Di，通過CNO抑制hM4Di陽性神經(jīng)元，并在小鼠海馬注射紅藻氨酸（KA）以誘導(dǎo)顳葉癲癇（圖4a）。他們發(fā)現(xiàn)抑制SNr PV神經(jīng)元后，小鼠產(chǎn)生全面性癲癇與癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛時(shí)顯著增加，產(chǎn)生全面性癲癇與局灶性癲癇的次數(shù)顯著減少，腦電頻率上升的持續(xù)時(shí)間亦顯著減少（圖4b-f）。此外，抑制SNr PV神經(jīng)元后，KA誘導(dǎo)的慢性自發(fā)性癲癇亦顯著減少，表現(xiàn)在全面性癲癇與局灶性癲癇的次數(shù)和時(shí)間顯著減少（圖4g-l）。

他們還在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-hM3Dq，通過CNO激活hM3Dq陽性神經(jīng)元（圖4m）。他們發(fā)現(xiàn)，全面性癲癇與局灶性癲癇的次數(shù)和時(shí)間顯著增加，2只小鼠甚至死亡（圖4n-o）。

綜上所述，SNr PV神經(jīng)元可雙向調(diào)控顳葉癲癇，其中激活此類神經(jīng)元促進(jìn)顳葉癲癇，抑制此類神經(jīng)元延緩顳葉癲癇。

接下來，作者探究SNr PV神經(jīng)元通過哪個(gè)下游腦區(qū)調(diào)控顳葉癲癇。過去研究表明，丘腦是SNr PV神經(jīng)元的重要下游[12]，于是作者就SNr PV到丘腦多種核團(tuán)的投射展開以下研究。

他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ArchT，在丘腦束旁核（PF）、腹內(nèi)側(cè)核（VM）、網(wǎng)狀核（RT）或連結(jié)核（RE）植入光纖（圖5a-b）。他們發(fā)現(xiàn)，光抑制SNr PV神經(jīng)元投射到PF的神經(jīng)纖維末稍（SNr-PF PV 投射）延緩了海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇發(fā)作階段，縮短了后放電持續(xù)時(shí)間，弱化了顳葉癲癇的誘導(dǎo)過程（圖5c-e）,而光抑制其它三種投射則無此現(xiàn)象。他們又在PV-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2，在PF植入光纖，發(fā)現(xiàn)光激活SNr-PF PV 投射促進(jìn)了海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇發(fā)作過程，而在PF注射GABAA受體拮抗劑可阻斷這一過程（圖5f-i）。

以上結(jié)果表明，SNr PV神經(jīng)元通過PF調(diào)控海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇。

為進(jìn)一步探究SNr PV神經(jīng)元到PV神經(jīng)元的功能性投射，他們?cè)赑V-Cre小鼠的SNr注射AAV-DIO-ChR2，使用膜片鉗電生理方法記錄PF神經(jīng)元，通過發(fā)放的動(dòng)力學(xué)判斷記錄神經(jīng)元的細(xì)胞類型（圖6a）。他們發(fā)現(xiàn)在光激活SNr PV神經(jīng)元投射至PF纖維末梢的條件下，50% PF GABA能神經(jīng)元的發(fā)放頻率降低，19.2% PF谷氨酸能神經(jīng)元的發(fā)放頻率降低，而23.1% PF谷氨酸能神經(jīng)元的發(fā)放頻率升高（圖6b）。

為證實(shí)SNr到PF GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性直接投射，作者在Vgat-Cre小鼠的SNr中注射AAV-DIO-ChR2（這里，通過GABA能神經(jīng)元表征PV神經(jīng)元。因?yàn)樵赟Nr中，PV神經(jīng)元占GABA能神經(jīng)元很大一部分），在PF中注射AAV-DIO-eYFP，并記錄PF中eYFP陽性神經(jīng)元（圖6c-d）。他們加入河豚毒素和4-氨基吡啶（TTX 4-AP）抑制神經(jīng)元發(fā)放以阻斷間接投射，發(fā)現(xiàn)在一些PF GABA能神經(jīng)元中可記錄到突觸后電流，此突觸后電流可被GABAA受體拮抗劑阻斷（圖6e），表明SNr到PF GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生GABA介導(dǎo)的抑制性直接投射。

為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論，作者使用基于狂犬病毒（RV）的逆行示蹤手段，他們?cè)赩gat-Cre小鼠的PF中注射RV和輔助AAV，發(fā)現(xiàn)SNr中存在大量PF GABA能神經(jīng)元的上游神經(jīng)元，其中62.83 ± 3.23% 上游神經(jīng)元為PV陽性，~30% SNr PV神經(jīng)元為PF GABA能神經(jīng)元的上游神經(jīng)元（圖6f-i）。

綜上，SNr PV神經(jīng)元直接投射到PF GABA能神經(jīng)元，此抑制性投射由GABA所介導(dǎo)。

圖6  PF GABA能神經(jīng)元接受

SNr PV神經(jīng)元的抑制性直接投射

上文已知，SNr-PF PV 投射雙向調(diào)控顳葉癲癇，SNr-PF PV 投射主要下游為PF GABA神經(jīng)元，那么PF GABA能神經(jīng)元是否同樣具有顳葉癲癇的調(diào)控功能呢？作者就此展開研究。

他們?cè)赩gat-Cre的PF中注射AAV-DIO-ArchT并植入光纖，發(fā)現(xiàn)光抑制PF GABA能神經(jīng)元促進(jìn)了海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇發(fā)作階段，延長了了后放電持續(xù)時(shí)間，強(qiáng)化了顳葉癲癇的誘導(dǎo)過程（圖7a-f）。他們還通過ChR2或hM3Dq激活PF GABA能神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)激活這些神經(jīng)元會(huì)抑制海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇，具體的結(jié)果與上文一致（圖7g-q）。

以上結(jié)果表面，PF GABA能神經(jīng)元雙向調(diào)控顳葉癲癇，其中激活此類神經(jīng)元抑制顳葉癲癇，抑制此類神經(jīng)元促進(jìn)顳葉癲癇，與SNr PV神經(jīng)元的調(diào)控作用相反。

最后，作者探究PF谷氨酸能神經(jīng)元的功能。他們使用在體電生理手段記錄麻醉小鼠PF的GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元，通過單側(cè)海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)顳葉癲癇。他們發(fā)現(xiàn)在同側(cè)PF中，54.5% GABA能神經(jīng)元被抑制，極少數(shù)被激活；50%谷氨酸能神經(jīng)元被激活，極少數(shù)被抑制（圖8a-c）。此外，光激活PF GABA能神經(jīng)元會(huì)抑制PF谷氨酸能神經(jīng)元（圖8d），表面SNr PV神經(jīng)元可能通過PF GABA能神經(jīng)元去抑制PF谷氨酸能神經(jīng)元。

他們還發(fā)現(xiàn)，光抑制PF谷氨酸能神經(jīng)元延緩海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程（圖8e-h）；而光激活PF谷氨酸能神經(jīng)元促進(jìn)海馬點(diǎn)燃誘導(dǎo)的顳葉癲癇過程（圖8i-l），表明PF谷氨酸能神經(jīng)元亦雙向調(diào)控顳葉癲癇，其中激活此類神經(jīng)元促進(jìn)顳葉癲癇，抑制此類神經(jīng)元延緩顳葉癲癇。

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在神經(jīng)科其患者數(shù)量?jī)H次于頭痛病，其中顳葉癲癇尤為難治。因此，解析調(diào)控顳葉癲癇的腦神經(jīng)環(huán)路對(duì)臨床治療顳葉癲癇十分重要。過去研究顯示，SNr很可能參與顳葉癲癇的調(diào)控過程，然而對(duì)于其中參與顳葉癲癇的細(xì)胞類型、下游腦區(qū)及其環(huán)路機(jī)制，我們知之甚少。本文結(jié)合疾病模型構(gòu)建、光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)、電生理等方法，發(fā)現(xiàn)SNr PV神經(jīng)元、PF GABA能神經(jīng)元、PF谷氨酸能神經(jīng)元均參與顳葉癲癇的調(diào)控過程，其中SNr神經(jīng)元與PF GABA能神經(jīng)元之間形成抑制性突觸聯(lián)系。此抑制性投射去抑制PF谷氨酸能神經(jīng)元，進(jìn)而調(diào)控顳葉癲癇（圖9）。這項(xiàng)研究闡釋了調(diào)控顳葉癲癇的腦區(qū)及其神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，為治療顳葉癲癇提供了新型藥物靶點(diǎn)！

圖9  SNr PV神經(jīng)元投射到PF的去抑制環(huán)路示意圖