microRNA是來源于前體轉(zhuǎn)錄本的約22核苷酸的非編碼RNA調(diào)控序列【1】。每個miRNA都與一個Argonaute（AGO）蛋白形成一個沉默復(fù)合體，miRNA與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本配對隨后AGO蛋白促進靶標(biāo)變得不穩(wěn)定或者是進行轉(zhuǎn)錄抑制【2】。哺乳動物中最保守的90個miRNA家族有平均超過400個保守的靶標(biāo)。這保守的90個miRNA家族通過小鼠中的敲除實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于動物的正常生長發(fā)育和生理過程有著非常重要的作用【1】。miRNA結(jié)合靶點的效率對于理解miRNA的作用過程和作用機制大有裨益，但是對于miRNA-AGO復(fù)合物與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間結(jié)合親和力的檢測一直沒有很好的方法。

近日，Whitehead研究所David P. Bartel研究組在Science發(fā)表文章The biochemical basis of microRNA targeting efficacy，對RNA bind-n-seq（RBNS）測序進行優(yōu)化，用于測量miRNA-AGO復(fù)合體與所有小于12nt靶標(biāo)結(jié)合的相對親和力的大小，為定量測量miRNA對于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合效率提供了重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。

靶標(biāo)結(jié)合的效率是miRNA-AGO復(fù)合體與靶標(biāo)序列之間的親和力的大小，在這種情況下，與目標(biāo)位點的更大親和力將導(dǎo)致該位點的占用率增加，從而增加對目標(biāo)mRNA的抑制。直到最近，僅有三個miRNA對于極少數(shù)的靶標(biāo)mRNA的結(jié)合親和力是被深入研究過的【3-5】。高通量的成像和切割分析提供了眾多miRNA中僅let-7a和miR-21兩個的大量結(jié)合和切割方面的數(shù)據(jù)【6】。但是這其中給出的數(shù)據(jù)仍然不足以對不同miRNA之間的靶向性不同機理更加深入的了解，也無法建立miRNA介導(dǎo)的抑制作用相關(guān)的、更為普遍的非切割模式的靶向效能信息生化模型【6】。

為了能夠擴展目前對于miRNA結(jié)合靶標(biāo)親和力的認識，作者們對RBNS技術(shù)進行了升級改造【7】，RBNS技術(shù)可以提供對RNA結(jié)合蛋白與結(jié)合位點的相對結(jié)合的定性測量。在該方法中，純化后的RNA結(jié)合蛋白與一個大的RNA分子庫進行孵育，所有的RNA分子都具有一個相同的引物結(jié)合序列。在達到結(jié)合平衡后，該蛋白被pull-down下來，任何被共同純化下來的RNA分子被反轉(zhuǎn)錄、擴增然后進行測序（圖1）。為了將該技術(shù)擴展到對于AGO-miRNA復(fù)合體中進行使用，作者們純化了AGO2-miR-1【8】，并且設(shè)置了五個不同濃度的結(jié)合反應(yīng)實驗，以及具有37nt隨機結(jié)合序列的RNA庫。進一步地，作者們在pull-down蛋白時改用了硝化纖維素膜，可以增加低親和力蛋白的滯留。優(yōu)化后的方法提供了AGO2對于其結(jié)合位點的相對強度的量化，而且沒有差異交聯(lián)效率的混淆效應(yīng)，使得該方法能夠用于miRNA靶向的定量測量。

隨后作者使用優(yōu)化后的RBNS對另外的哺乳動物中l(wèi)et-7、miR-7、miR-124、miR-155以及線蟲中l(wèi)sy-6的這五個miRNA的結(jié)合親和力進行了測量。選擇let-7、miR-7、miR-124、miR-155是因為這些miRNA序列保守而且已經(jīng)對于其調(diào)控活性、體內(nèi)結(jié)合位點以及體外的結(jié)合親和力數(shù)據(jù)有一定的了解。而選擇lsy-6是因為該miRNA已知對于其靶點的結(jié)合能力非常微弱。作者們通過RBNS后的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)這些miRNA對于經(jīng)典靶點具有很好的結(jié)合，說明該高通量技術(shù)具有很好的適應(yīng)性。而對于一些非經(jīng)典的結(jié)合，部分在之前的文章中有零星報道，而另外一些非經(jīng)典的結(jié)合可能是對于哺乳動物細胞中有著廣泛的抑制，數(shù)據(jù)結(jié)果與背景無太大差異。

為了進一步確認該技術(shù)的作用，作者們在細胞中對miRNA轉(zhuǎn)染后對于靶點抑制效率與其測量得到的相對平衡解離常數(shù)之間的對應(yīng)進行檢測。作者們發(fā)現(xiàn)在細胞中的結(jié)果與相對KD常數(shù)之間有著很好的對應(yīng)關(guān)系。有了這樣在細胞內(nèi)相對一致的抑制關(guān)系，作者們通過測量一個miRNA與任何12nt序列的相對結(jié)合親和力，來模擬6個miRNA對每個細胞mRNA的定量影響，建立了一個生物化學(xué)框架用以預(yù)測一個miRNA對于每個mRNA的抑制程度。

總的來說，作者們通過將RBNS技術(shù)進行改造，建立了一種對miRNA-AGO復(fù)合體與靶點高通量相對結(jié)合親和力檢測的方式，建立了對于miRNA-靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)，對于未來更好地了解和預(yù)測miRNA靶向功能提供了重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。

1. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell 173, 20-51, doi:10.1016/j.cell.2018.03.006 (2018).

2. Jonas, S. & Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet 16, 421-433, doi:10.1038/nrg3965 (2015).

3. Wee, L. M., Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E. & Zamore, P. D. Argonaute divides its RNA guide into domains with distinct functions and RNA-binding properties. Cell 151, 1055-1067, doi:10.1016/j.cell.2012.10.036 (2012).

4. Schirle, N. T., Sheu-Gruttadauria, J. & MacRae, I. J. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613, doi:10.1126/science.1258040 (2014).

5. Salomon, W. E., Jolly, S. M., Moore, M. J., Zamore, P. D. & Serebrov, V. Single-Molecule Imaging Reveals that Argonaute Reshapes the Binding Properties of Its Nucleic Acid Guides. Cell 162, 84-95, doi:10.1016/j.cell.2015.06.029 (2015).

6. Becker, W. R. et al. High-Throughput Analysis Reveals Rules for Target RNA Binding and Cleavage by AGO2. Mol Cell 75, 741-755 e711, doi:10.1016/j.molcel.2019.06.012 (2019).

7. Lambert, N. et al. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell 54, 887-900, doi:10.1016/j.molcel.2014.04.016 (2014).

8. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E. & Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA 19, 271-279, doi:10.1261/rna.036921.112 (2013).