SOP單抗融合步驟：

1、實(shí)驗(yàn)必備（以下器材/試劑必須全部準(zhǔn)備齊全才可以開始操作）：

Frdbio單抗融合器材/試劑準(zhǔn)備表

細(xì)胞融合需要準(zhǔn)備的材料

2、試劑配制：

1）實(shí)驗(yàn)前取PEG1450 1ml于無菌EP管37℃預(yù)溫；

2）HAT完全培養(yǎng)基：20%胎牛血清+1%雙抗(鏈霉素和青霉素)+1/50體積的HAT（50×）+1640不完全培養(yǎng)基，按每塊96孔板20ml配制，于37℃預(yù)溫；

3）分取50ml 1640不完全培養(yǎng)基37℃預(yù)溫（融合后稀釋PEG用）。

3、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

實(shí)驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)要用到的離心管、離心管架、剪子、鑷子、勻漿器、細(xì)胞篩網(wǎng)、培養(yǎng)皿、固定板等放入超凈臺(tái)，紫外照射30min左右。

4、飼養(yǎng)細(xì)胞/融合細(xì)胞準(zhǔn)備

A. 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備（可在融合前一天完成，亦可當(dāng)天制備）：

1) 取空白Balb/c小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，并且用鑷子將其夾住在乙醇中不時(shí)攪動(dòng)使其充分消毒；

2) 將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內(nèi)面朝上），用鑷子將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精；

3) 取無菌固定針頭將老鼠側(cè)臥固定（身體左側(cè)向上）在固定板上；

4) 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的腹部皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側(cè)皮毛不要接觸內(nèi)部）；

5) 取10ml 1640不完全培養(yǎng)基在干凈的滅菌玻璃培養(yǎng)皿里，用10ml注射器取5ml培養(yǎng)基，用一個(gè)滅菌鑷子輕輕提起老鼠的腹膜，將5ml培養(yǎng)基打入老鼠腹部，同時(shí)輕輕按摩老鼠的腹部1分鐘后，將培養(yǎng)基回收，置于50ml無菌離心管中，再次吸取5ml培養(yǎng)基，可重復(fù)此步驟多次（此步為取腹腔細(xì)胞步驟，如不需則省略）；

6) 取3-5ml培養(yǎng)基放入勻漿器中，用剪刀和鑷子，將鼠腹腔剖開，取出其左側(cè)的脾臟剪去表面脂肪，放進(jìn)勻漿器中輕輕研磨；

7) 將研磨的液體通過細(xì)胞篩網(wǎng)過濾掉塊狀物；

8) 取3-5ml培養(yǎng)基沖洗勻漿器，再次過篩網(wǎng)；

9) 將細(xì)胞篩網(wǎng)過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，若取了腹腔細(xì)胞可合并置于50ml無菌離心管中，加培養(yǎng)基至30ml，離心1,500rpm，5min，棄上清；

10) 將沉淀重懸于HAT完全培養(yǎng)基，此時(shí)飼養(yǎng)細(xì)胞已制備好，可按105/孔使用，于融合前一天鋪板105個(gè)/100μl/孔，亦可當(dāng)天隨融合細(xì)胞混合鋪板。

B. 免疫脾細(xì)胞制備：

1) 取空白Balb/c小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，并且用鑷子將其夾住在乙醇中不時(shí)攪動(dòng)使其充分消毒；

2) 將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內(nèi)面朝上），用鑷子將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精；

3) 取無菌固定針頭將老鼠側(cè)臥固定（身體左側(cè)向上）在固定板上；

4) 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的腹部皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側(cè)皮毛不要接觸內(nèi)部）；

5) 取10ml 1640不完全培養(yǎng)基在干凈的滅菌玻璃培養(yǎng)皿里，用10ml注射器取5ml培養(yǎng)基，用一個(gè)滅菌鑷子輕輕提起老鼠的腹膜，將5ml培養(yǎng)基打入老鼠腹部，同時(shí)輕輕按摩老鼠的腹部1分鐘后，將培養(yǎng)基回收，置于50ml無菌離心管中，再次吸取5ml培養(yǎng)基，可重復(fù)此步驟多次（此步為取腹腔細(xì)胞步驟，如不需則省略）；

6) 取3-5ml培養(yǎng)基放入勻漿器中，用剪刀和鑷子，將鼠腹腔剖開，取出其左側(cè)的脾臟剪去表面脂肪，放進(jìn)勻漿器中輕輕研磨；

7) 將研磨的液體通過細(xì)胞篩網(wǎng)過濾掉塊狀物；

8) 取3-5ml培養(yǎng)基沖洗勻漿器，再次過篩網(wǎng)；

9) 將細(xì)胞篩網(wǎng)過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，若取了腹腔細(xì)胞可合并置于50ml無菌離心管中，加培養(yǎng)基至30ml，離心1,500rpm，5min，棄上清，1640不完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，備用。

C. SP2/0細(xì)胞制備：

如果SP2/0為培養(yǎng)細(xì)胞，直接吹打懸浮起來后離心即可計(jì)數(shù)使用。

如果為實(shí)體瘤SP2/0，按以下步驟操作：

1) 取花生米大小實(shí)體瘤的小鼠，眼球取血處死，將其浸入75%乙醇中5min，鑷子夾住在乙醇中攪動(dòng)使其充分消毒；

2) 將滅過菌的濾紙鋪在固定板上（內(nèi)面朝上），用鑷子將老鼠從75%酒精中取出，瀝干酒精；

3) 取無菌固定針頭將老鼠側(cè)臥固定（身體左側(cè)向上）在固定板上；

4) 用滅菌鑷子輕輕拉起老鼠的腹部皮膚，用滅菌剪刀從下往上剪開一道口子，沿口子將老鼠的皮膚撕開，將其固定（注意：老鼠外側(cè)皮毛不要接觸內(nèi)部）；

5) 用鑷子和剪刀剪下實(shí)體瘤（實(shí)體瘤以均勻棕白色，質(zhì)地松軟不液化為宜，液化部分多為死細(xì)胞）放入勻漿器中加入3-5ml1640不完全培養(yǎng)基研磨；

6) 將研磨的液體通過細(xì)胞篩網(wǎng)過濾掉塊狀物；

7) 取3-5ml1640不完全培養(yǎng)基沖洗勻漿器，再次過篩網(wǎng)；

8) 將經(jīng)過細(xì)胞篩網(wǎng)過濾的液體吸入干凈的50ml無菌離心管中，加培養(yǎng)基至30ml離心1,500rpm，5min，棄上清，1640不完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，備用。

注：以上A、B、C三個(gè)步驟可以同時(shí)進(jìn)行，融合時(shí)細(xì)胞離體時(shí)間越短其融合效果越好。

5、融合操作步驟

1) 用1640不完全培養(yǎng)基將SP2/0細(xì)胞和免疫鼠脾細(xì)胞重懸，分別用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按脾細(xì)胞：SP2/0細(xì)胞=1:3比例于50ml無菌離心管中混合，充分混合后加1640不完全培養(yǎng)基至40ml；

2) 離心1,500rpm 5min ；

此時(shí)準(zhǔn)備37℃的溫水

3) 離心后棄上清以及管壁液體（可用滅菌吸水紙條吸干），輕輕敲打SP2/0細(xì)胞和免疫鼠細(xì)胞混合沉淀使其松動(dòng)，將離心管底部浸入37℃溫水中；

4) 從培養(yǎng)箱中取出已溫育的1ml融合劑PEG1450，60s內(nèi)均勻滴入細(xì)胞混合沉淀中（邊滴加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管）；

5) 靜置溫育45s，取出37℃溫箱中預(yù)熱的1640不完全培養(yǎng)基，取1ml，60s均勻滴入沉淀中（邊滴加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管），再取1ml，30s內(nèi)均勻滴入，之后將剩余的45ml培養(yǎng)基全部慢慢滴入；

注意：不要用力沖擊！此步驟為稀釋融合劑。

6) 輕輕顛倒混勻后，離心1,500rpm 5min，棄上清；

7) 用含有飼養(yǎng)細(xì)胞和HAT完全培養(yǎng)基溶液200ml重懸細(xì)胞沉淀；若飼養(yǎng)細(xì)胞已提前鋪板，則只需用100ml的HAT完全培養(yǎng)基溶液重懸。

飼養(yǎng)細(xì)胞是一把雙刃劍,可以輔助融合雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng),但是對(duì)于入門新手來說,如果操作不當(dāng)除了增加污染的風(fēng)險(xiǎn)外,還可能由于使用量太少達(dá)不到輔助作用,或者使用量太大,與融合細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng),對(duì)融合造成毀滅性破壞。

福因德生物通過研究雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的規(guī)律,發(fā)現(xiàn)對(duì)對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著的是IL-6,EGF等，通過調(diào)配這些生長(zhǎng)因子的比例和濃度，使雜交瘤細(xì)胞處于最優(yōu)生長(zhǎng)環(huán)境，研發(fā)出雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)添加劑單抗初學(xué)者可以選擇此產(chǎn)品，使用此產(chǎn)品后無需再添加飼養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞融合后長(zhǎng)出的細(xì)胞集落均勻，細(xì)胞孔背景干凈。

6、雜交瘤細(xì)胞鋪板培養(yǎng)：

a) 96孔板液體培養(yǎng)：

1) 用排槍將重懸后的細(xì)胞均勻鋪入96細(xì)胞培養(yǎng)板，200μl/孔（若飼養(yǎng)細(xì)胞已提前鋪好，則只需每孔加100μl即可）；

2) 鋪好后置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，用HAT完全培養(yǎng)基換液一半。

b) 半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：

1) 取2%甲基纖維半固體培養(yǎng)基（1×1640不完全培養(yǎng)基+1×HAT+1%雙抗+20%胎牛血清）20ml，加入20ml融合細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（HAT完全培養(yǎng)基），再加入2ml促進(jìn)雜交瘤形成添加物因子，充分混勻后，倒入6孔板，3ml/孔；

2) 6孔板置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，長(zhǎng)出白色集落，挑取白色集落至含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。

7、雜交瘤陽性細(xì)胞孔的篩選

陽性細(xì)胞孔的篩選一般采用間接ELISA法。

1）抗原最佳包被濃度的確定

參照《抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)》章節(jié)；

在進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)之前必須用陽性免疫血清建立好ELISA檢測(cè)方法。

2）雜交瘤細(xì)胞孔的檢測(cè)

按照最佳包被濃度包被ELISA板，封板后，取雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入酶標(biāo)板孔，每孔100μl;孵育洗滌后，分別加入HRP標(biāo)記羊抗小鼠，底物顯色，讀取OD值。

3）陽性細(xì)胞株/陽性孔的選取

選取陽性值最高的孔予以保留并進(jìn)行亞克隆。

具體該選擇保留多少孔根據(jù)項(xiàng)目實(shí)際需求決定。

8、陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆

1)培養(yǎng)基的配制

第一次亞克隆，一般用HT完全培養(yǎng)基（含1×HT和20%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基），配制方法：20%胎牛血清+1%雙抗(鏈霉素和青霉素)+1/50體積的HT（50×）+1640不完全培養(yǎng)基

2）飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備

參照以上《4、飼養(yǎng)細(xì)胞/融合細(xì)胞準(zhǔn)備》相關(guān)內(nèi)容，最后將細(xì)胞重懸在HT完全培養(yǎng)基，備用。

3）細(xì)胞亞克隆

細(xì)胞亞克隆的目的是為了得到單個(gè)細(xì)胞（單克隆）分裂生長(zhǎng)的細(xì)胞，這樣所產(chǎn)生的抗體的性質(zhì)都是一樣的。一般采用有限稀釋法，當(dāng)然也可以考慮半固體培養(yǎng)基法。半固體培養(yǎng)基法可參照以上《雜交瘤細(xì)胞鋪板培養(yǎng)中》的《半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)》相關(guān)內(nèi)容，本節(jié)內(nèi)容主要介紹有限稀釋法：

傳統(tǒng)教科書和參考資料一般是建議將細(xì)胞稀釋到平均每孔0.8個(gè)細(xì)胞，此時(shí)含有單個(gè)細(xì)胞的孔的概率最高；但是，這個(gè)方法并不科學(xué)，原因是不同實(shí)驗(yàn)體系對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的支持并不一樣，并不是沒有單細(xì)胞都可以順利存活成長(zhǎng)起來，所以，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)體系測(cè)試最佳的單孔平均細(xì)胞個(gè)數(shù)。

陽性細(xì)胞稀釋到平均每孔某個(gè)確定的個(gè)數(shù)，分種到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板里，置于5% CO2 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天左右觀察，選取只含有單集落細(xì)胞孔進(jìn)行上清檢測(cè)；如果單集落孔達(dá)到50%以上，且所選擇的單集落孔檢測(cè)的結(jié)果為100%陽性即可認(rèn)為此細(xì)胞為單克隆細(xì)胞株，以雜交瘤細(xì)胞原始孔編號(hào)為其命名；將細(xì)胞株放大，可進(jìn)行腹水生產(chǎn)。如果檢測(cè)結(jié)果達(dá)不到100%陽性則需要從本次亞克隆所獲得細(xì)胞株中陽性值最高的孔繼續(xù)進(jìn)行第二次亞克隆。

亞克隆得到的細(xì)胞株需要進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證，ELISA驗(yàn)證只能算是篩選；常見的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證條件有免疫印跡（Western Blot），免疫熒光(IF)、免疫組化(IHC）等等，如果要進(jìn)行下游產(chǎn)品開發(fā)還需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

9、 細(xì)胞株的凍存

雜交瘤細(xì)胞凍存是單抗中重要環(huán)節(jié)

SOP 凍存標(biāo)準(zhǔn)步驟

1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞重懸起來，1,500rpm離心5min,去除上清；

2)加入適量的細(xì)胞凍存液（10% DMSO，20%-50%胎牛血清，1640培養(yǎng)基），輕輕吹打重懸細(xì)胞，使終濃度達(dá)到0.5～1×107個(gè)/ml;

3)將細(xì)胞分裝入細(xì)胞專用凍存管，每管1.0～1.5ml,在管子上標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞名稱、凍存日期和凍存人；

4）凍存降溫程序：-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中；

如果實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件受限，可以采取以下的操作流程：-20℃冰箱2h ，-70℃冰箱過夜，然后移入液氮中；還可以直接將細(xì)胞凍存管裹上厚厚的棉套，直接放入-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮保存。

細(xì)胞凍存中常用凍存液為DMSO,DMSO的純度對(duì)凍存細(xì)胞至關(guān)重要，建議使用細(xì)胞凍存專用級(jí)別的；

細(xì)胞融合孔檢測(cè)到陽性，如果來不及亞克隆往往只能眼睜睜看著細(xì)胞株丟失，福因德生物為了解決此類問題專門研發(fā)96孔板整板細(xì)胞凍存液，凍存液使用方便，加入凍存板直接放入-80℃冰箱即可。