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“健康衰老”近年逐漸成為大眾和科研工作者關(guān)注和研究的熱點，衰老及相關(guān)疾病已成為困擾人民和國家社會保障的一大難題。據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)，2018年，我國65歲及以上人口比重已達(dá)11.9%，人口老齡化程度持續(xù)加劇。這大大增加了勞動年齡人口的壓力，同時也給我國社會保障、經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大的挑戰(zhàn)。細(xì)胞是機(jī)體組織器官最基本的單元，因此想要解決健康衰老的難題，我們首先要探究細(xì)胞內(nèi)部的染色質(zhì)、線粒體、各種大分子以及代謝等在衰老過程中會有怎樣的變化，以及我們該如何鑒別他們的變化。對于以上的問題，來自不同學(xué)科的研究者們有著不同的理解，同時由于實驗條件等方面的不同，研究者們對于衰老細(xì)胞的評價也存在著差異。這嚴(yán)重阻礙了衰老領(lǐng)域的研究。因此，學(xué)者們急需對細(xì)胞衰老的特征與生物標(biāo)志物達(dá)成共識。2019年10月31日，來自美國、法國、英國、德國、以色列等國家的衰老研究者們所成立的“國際細(xì)胞衰老學(xué)會”（International Cell Senescence Association, ICSA）就細(xì)胞衰老的特征與生物標(biāo)志物達(dá)成共識。Vassilis Gorgoulis教授等作為共同通訊作者在Cell上發(fā)表題為“Cellular Senescence: Defining a Path Forward”的文章，介紹了共識的內(nèi)容，主要包括細(xì)胞衰老的定義、特征、現(xiàn)階段的檢測技術(shù)及面臨的挑戰(zhàn)等。 Vassilis Gorgoulis教授 
細(xì)胞衰老（Cellular senescence）是一種細(xì)胞狀態(tài)，與多種生理過程及衰老相關(guān)疾病密切相關(guān)。近年來，人們對以細(xì)胞衰老為靶點來改善健康、治療衰老相關(guān)疾?。此ダ霞?xì)胞清除療法）越來越感興趣，而準(zhǔn)確清除衰老細(xì)胞是這一療法的關(guān)鍵點。在此，我們與國際細(xì)胞衰老協(xié)會（the International Cell Senescence, ICSA）提出一個共識，定義并討論了衰老過程中的關(guān)鍵細(xì)胞及分子特征，同時還給出了如何使用這些生物標(biāo)記物的建議。此外，我們開發(fā)了一個資源工具-SeneQuest （http://Senequest.net），以幫助確定衰老相關(guān)基因，也提出了一種可以在培養(yǎng)的細(xì)胞及體內(nèi)準(zhǔn)確評估和量化衰老的算法。生理或應(yīng)激信號刺激細(xì)胞，改變細(xì)胞狀態(tài)，并最終影響組織穩(wěn)態(tài)及個體健康。然而，生理和應(yīng)激信號導(dǎo)致的結(jié)果是不同的，受信號特征（類型、大小和持續(xù)時間）、時空和細(xì)胞應(yīng)答能力等因素影響。細(xì)胞在受到潛在損傷壓力時，損傷可被修復(fù)，細(xì)胞能夠恢復(fù)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。但當(dāng)損傷不可逆轉(zhuǎn)時，細(xì)胞就會激活死亡機(jī)制以減弱對組織的損傷。除此之外，當(dāng)細(xì)胞面臨不可逆轉(zhuǎn)的損傷時，也可以轉(zhuǎn)化為另一種有利于生存的狀態(tài)，但通常會伴隨著永久性的結(jié)構(gòu)和功能的改變。例如，細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)樗ダ蠣顟B(tài)（細(xì)胞保持活性但不增殖)，細(xì)胞衰老狀態(tài)不同于細(xì)胞G0期靜息狀態(tài)及終末分化狀態(tài)。“細(xì)胞衰老”一詞來源于拉丁語 “senex”，意為”年老的“，并在1961年由Hayflick及其同事首次正式描述。細(xì)胞衰老這一現(xiàn)象最初是在有限次分裂（Hayflick limit）后停止增殖的正常二倍體細(xì)胞中觀察到的。后來，研究者們證實這種現(xiàn)象是由端粒縮短造成的（詳見“細(xì)胞周期停滯”章節(jié)）。
細(xì)胞衰老被認(rèn)為是對多種壓力信號的反應(yīng)，包括：暴露于遺傳毒性劑、營養(yǎng)缺乏、缺氧、線粒體功能障礙及原癌基因激活等（表1）。在過去十年間，不斷改進(jìn)的實驗工具及小鼠模型的建立都大大擴(kuò)寬了我們對衰老細(xì)胞起因及表型的認(rèn)識。然而，目前業(yè)界關(guān)于衰老細(xì)胞的組成及典型標(biāo)志還沒有達(dá)成共識。此外，盡管細(xì)胞衰老與個體衰老密切相關(guān)，但是個體衰老（aging）與細(xì)胞衰老（senescence）的意義是不同的。在個體發(fā)育的各個階段都存在大量誘導(dǎo)衰老信號（包括不依賴于端?？s短的信號），因此，細(xì)胞衰老貫穿整個生命周期，包括胚胎發(fā)生期（細(xì)胞衰老發(fā)揮著促進(jìn)組織發(fā)育的作用）及成年期（細(xì)胞衰老在此階段發(fā)揮著阻止損傷細(xì)胞擴(kuò)增，促進(jìn)組織修復(fù)及增強(qiáng)腫瘤抑制的作用）。因此，細(xì)胞衰老可能是進(jìn)化中多種因素相互拮抗的一個例子，也可能是一種既具有有益影響，又具有有害影響的細(xì)胞程序。在此，我們闡述了細(xì)胞衰老的幾個特性，包括（1）細(xì)胞衰老的關(guān)鍵特征、（2）衰老的綜合定義、（3）鑒定衰老細(xì)胞的方法、（4）衰老細(xì)胞在生理和病理過程中的作用，為開發(fā)新的治療策略奠定基礎(chǔ)。
表1.引發(fā)衰老的因素 細(xì)胞衰老是一種由壓力信號刺激產(chǎn)生，存在于特定生理過程的細(xì)胞狀態(tài)，具有典型的細(xì)胞周期停滯、衰老相關(guān)分泌表型、大分子損傷及代謝紊亂特征（表1）。這些特征相互聯(lián)系（圖1）。下面將分別詳細(xì)描述這些特征。
圖 1. 細(xì)胞衰老標(biāo)志表型。衰老細(xì)胞表現(xiàn)出以下四個相互關(guān)聯(lián)的特征：（1）細(xì)胞周期停滯；（2）大分子損傷；（3）衰老相關(guān)分泌表型（SASP）；（4）代謝紊亂（詳見正文）。 衰老細(xì)胞的一個共同特征是不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞周期停滯，可能是由有害刺激或異常增殖引起的警報反應(yīng)。這種細(xì)胞周期停滯與細(xì)胞靜息狀態(tài)和終末分化均不同。細(xì)胞靜息狀態(tài)是一個暫時的停滯狀態(tài)，當(dāng)合適的刺激存在時，細(xì)胞會重新進(jìn)入增值狀態(tài)。終末分化是細(xì)胞為獲得特定的功能所進(jìn)入的狀態(tài)，并伴隨著持久的細(xì)胞周期停滯，但其介導(dǎo)途徑與細(xì)胞衰老途徑不同（圖2）。與之相反，衰老細(xì)胞會獲得一種新的表型，雖然衰老細(xì)胞周期停滯通常是不可逆轉(zhuǎn)的，但在某些特殊情況下，特別是在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞可以重新進(jìn)入細(xì)胞周期（圖2）。在哺乳動物細(xì)胞中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma, RB）家族和p53蛋白對于衰老細(xì)胞周期停滯至關(guān)重要。RB1和其家族成員p107（RBL1）、p130（RBL2）可以被特定的細(xì)胞周期素依賴性激酶（Cyclin-Dependent Kinases, CDKs: CDK4, CDK6, CDK2）磷酸化。其磷酸化可以減弱RB家族抑制E2F家族轉(zhuǎn)錄激活因子的活性。然而，在衰老細(xì)胞中，CDK2的抑制因子p21 WAF/Cip1（CDKN1A）和CDK4/6的抑制因子p16INK4A（CDKN2A）會發(fā)生積累。這種積累促使RB家族蛋白持續(xù)活化，抑制E2F的反式激活，從而導(dǎo)致無法逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞周期停滯，即使RB家族蛋白或p53隨后被失活，這種細(xì)胞周期停滯也很難得到逆轉(zhuǎn)。細(xì)胞周期停滯的持久性是通過E2F（轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白E和A）靶基因的異染色質(zhì)化、衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及持續(xù)性的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)產(chǎn)生實現(xiàn)的。值得注意的是，在衰老的小鼠細(xì)胞中，p16INK4A基因位點的另一種閱讀框蛋白ARF (Alternate Reading Frame)也在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯中起著重要作用。衰老細(xì)胞周期停滯的其他特征包括核糖體生物發(fā)生缺陷和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的去抑制。然而，準(zhǔn)確的細(xì)胞周期停滯相關(guān)標(biāo)記還沒有發(fā)現(xiàn)。例如，RB和p53的蛋白激活也發(fā)生在其它形式的細(xì)胞周期停滯中。即使是相對特異的衰老相關(guān)標(biāo)記—p16INK4A也會在特定的非衰老細(xì)胞中表達(dá)，且并不是在所有衰老細(xì)胞中都表達(dá)。因此，檢測衰老相關(guān)的細(xì)胞周期停滯需要量化多種因素和特征。
圖 2. 衰老細(xì)胞、靜息狀態(tài)細(xì)胞和終末分化細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯。圖中顯示了細(xì)胞周期停滯在可逆性、激活信號（見正文）、分泌功能和大分子損傷等方面的差異，這些差異可用來區(qū)分這些細(xì)胞狀態(tài)。大分子損傷是衰老的共同特征，而分泌則是衰老所共有的另一個的特征，有時（環(huán)境依賴性）也在分化狀態(tài)有發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞周期停滯被認(rèn)為在衰老和終末分化的過程中是不可逆的，但細(xì)胞在某些條件下也會重新進(jìn)入細(xì)胞周期。綠色字體：激活和/或存在，紅色字體：抑制和/或不存在。箭頭表示細(xì)胞狀態(tài)之間的聯(lián)系。 衰老細(xì)胞會分泌大量的因子，包括促炎細(xì)胞因子和趨化因子、生長調(diào)節(jié)劑、血管生成因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs），統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP）或衰老信息分泌組（Senescence Messaging Secretome, SMS）（圖1；表2）。SASP是衰老細(xì)胞的標(biāo)志之一，它介導(dǎo)了許多衰老細(xì)胞的病理生理效應(yīng)。例如，SASP可以以自分泌和旁分泌的方式增強(qiáng)和傳播衰老，激活免疫系統(tǒng)清除衰老細(xì)胞。SASP因子可以參與細(xì)胞衰老，傷口愈合，組織可塑性過程，同時也會造成持續(xù)的慢性炎癥（即“發(fā)炎”）。因此，SASP對于細(xì)胞會產(chǎn)生有害的、促衰老的作用。此外，SASP可以招募未成熟的免疫抑制性髓樣細(xì)胞到前列腺和肝臟腫瘤中，并通過驅(qū)動血管生成刺激腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。衰老細(xì)胞周期停滯受p53和p16INK4A/RB抑癌途徑調(diào)控，而SASP則受增強(qiáng)子重塑和轉(zhuǎn)錄因子激活的調(diào)控，如NF-κB、C/EBPβ、GATA4、雷帕霉素哺乳動物靶點（Mammalian target of rapamycin, mTOR）和p38-MAPK信號途徑。不同的衰老誘導(dǎo)因子可以通過多種上游信號通路激活SASP，包括DNA損傷、激活1型干擾素應(yīng)答的細(xì)胞質(zhì)染色質(zhì)片段（Cytoplasmic Chromatin Fragments, CCFs）、激活炎性小體的損傷相關(guān)分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）。根據(jù)衰老持續(xù)時間、促衰老刺激源和細(xì)胞類型的不同，SASP的組成和程度也會有很大差異。此外，單細(xì)胞RNA測序表明不同細(xì)胞間SASP的表達(dá)量也有明顯異質(zhì)性。例如，從早期轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）依賴性分泌蛋白到促炎分泌蛋白的轉(zhuǎn)變受Notch1活性的控制。此外，作為較為晚期SASP的事件，1型干擾素反應(yīng)在一定程度上是由于LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的去抑制所致。衰老細(xì)胞也可以通過旁分泌NOTCH/JAG1信號通路、活性氧（ROS）釋放、細(xì)胞質(zhì)橋和胞外囊泡（如外泌體），與微環(huán)境進(jìn)行交流?？偟膩碚f，在每個生物背景下定義衰老分泌組將有助于確定衰老相關(guān)分子特征。細(xì)胞衰老所體現(xiàn)出的第一個分子表征是端粒的縮短，主導(dǎo)原因為DNA末端復(fù)制出現(xiàn)“障礙”。端粒是在染色體末端的末端環(huán)中發(fā)現(xiàn)的，由端粒蛋白復(fù)合體穩(wěn)定的重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得端粒無法被DNA損傷應(yīng)答（DNA Damage Response, DDR）和雙鏈DNA斷裂（Double-Strand DNA break, DSB）修復(fù)途徑識別。端粒酶能夠維持端粒的長度，在大多數(shù)正常的體細(xì)胞（非干細(xì)胞）中并沒有表達(dá)，而大多數(shù)已經(jīng)越過衰老這一進(jìn)程的癌細(xì)胞中卻有表達(dá)。此外，正常細(xì)胞端粒酶活性的重新激活能夠延長端粒長度并增強(qiáng)其在培養(yǎng)中的傳代能力。端粒長度會隨著細(xì)胞增殖逐漸縮短，導(dǎo)致端粒DNA環(huán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性喪失以致端粒結(jié)構(gòu)破壞，端粒功能障礙致病灶（Telomere Dysfunction-Induced Foci, TIFs），激活DNA損傷應(yīng)答，最終阻滯細(xì)胞周期，同時也可以通過抑制或突變參與端粒維持的基因達(dá)到一樣的結(jié)果。端粒相關(guān)病灶（Telomere-Associated Foci, TAFs）是另一種形式的DNA損傷，由端粒G端重復(fù)序列的DNA氧化損傷導(dǎo)致，且其在端粒中的發(fā)生不因端粒長度或染色體丟失的情況而改變。盡管衰老細(xì)胞中近一半DNA的持續(xù)損傷都集中在端粒上，其他亞細(xì)胞毒性帶來的損傷壓力也可以通過誘導(dǎo)不可修復(fù)的DNA損傷來導(dǎo)致細(xì)胞衰老（圖1）。許多基因毒性物質(zhì)，包括輻射（電離和紫外線）、藥物因子（如某些化療藥物）和氧化應(yīng)激均可導(dǎo)致細(xì)胞衰老。此外，致癌基因的激活可作為一種腫瘤抑制反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞衰老，稱為癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（即Oncogenes Induced Senescence, OIS），從而抑制潛在癌變細(xì)胞的失控增殖。OIS通常由CDKN2A位點編碼的腫瘤抑制因子p16INK4A和ARF介導(dǎo)，使細(xì)胞周期強(qiáng)制終止。然而，DDR在觸發(fā)OIS方面也發(fā)揮了重要作用，這種情況的機(jī)理為：致癌基因驅(qū)動的過度增殖，使得損壞的復(fù)制叉出現(xiàn)損傷信號。最近的研究表明，在OIS過程中，DDR和ARF通路可以協(xié)同作用，且前者比后者需要的致癌負(fù)荷更低。衰老細(xì)胞有持續(xù)存在的核DNA損傷灶，稱為DNA-SCARSs（DNA segments with chromatin alterations reinforcing senescence）。DNA-SCARSs與瞬時損傷灶不同的是，它們與早幼粒細(xì)胞白血?。≒romyelocytic Leukemian, PML）的核體特異相關(guān)，缺乏DNA修復(fù)蛋白RPA和RAD51以及單鏈DNA （ssDNA），并含有活化的形式CHK2和p53（調(diào)控DDR）。DNA-SCARSs是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，可能調(diào)控衰老細(xì)胞包括生長停滯和衰老相關(guān)分泌表型等多個方面。然而，并不是所有細(xì)胞衰老引發(fā)的刺激都會產(chǎn)生持續(xù)的DNA損傷應(yīng)答，DNA-SCARSs并不是衰老細(xì)胞所共有的特征。CCFs是衰老細(xì)胞中另一種類型的DNA損傷。這些CCFs激活了由cGAS-cGAMP-STING通路介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)，可以作為另一個非廣譜性的衰老相關(guān)標(biāo)記物。蛋白毒性是個體衰老和細(xì)胞衰老的標(biāo)志。因此，蛋白質(zhì)損傷有助于識別衰老細(xì)胞（圖1）。ROS是蛋白質(zhì)損傷的一個重要來源，它能氧化蛋氨酸和半胱氨酸殘基，改變蛋白質(zhì)的折疊和功能。許多蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的活性部位存在的半胱氨酸殘基都能夠被氧化失活。這種失活可以通過激活ERK信號導(dǎo)致細(xì)胞衰老，這和激活的致癌基因的效果是類似的。在腫瘤前病變中檢測到了高水平的磷酸化的ERK（p-ERK），而在衰老細(xì)胞（如黑色素細(xì)胞痣和良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia, BPH）等）中，p-ERK大量富集，這也是誘導(dǎo)性衰老的特征。識別氧化半胱氨酸的單克隆抗體可以作為PTP氧化模式的標(biāo)記物。ROS在金屬離子存在時可以羰基化脯氨酸，蘇氨酸，賴氨酸和精氨酸殘基。蛋白質(zhì)羰基化使得疏水層暴露在外，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開以及聚集。蛋白質(zhì)羰基化殘基可以利用抗體特異性檢測。此外，羰基化殘基可以與氨基反應(yīng)形成希夫氏堿（Schiff bases）促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集，隨后與糖和脂類交聯(lián)形成不溶性多聚體，稱為脂褐素，源自希臘語“l(fā)ipo”，意為“脂肪”，“fuscus”意為“黑色的”。脂褐素可使用生物素蘇丹黑B（Sudan Black B, SBB）模擬物（GL13）（在體內(nèi)外衰老細(xì)胞的另一種指標(biāo)），可以通過光學(xué)顯微鏡或組織化學(xué)方法在溶酶體中觀察到。需要注意的是，即使細(xì)胞分裂停止，損傷的積累也會繼續(xù)并持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年。大多數(shù)蛋白質(zhì)的氧化損傷是不可逆的，泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin Proteasome System, UPS）或自噬降解往往會消除這些蛋白質(zhì)。由于UPS和自噬在衰老細(xì)胞中的呈現(xiàn)激活狀態(tài)，因此它們可以作為細(xì)胞衰老狀態(tài)的表征之一。同樣，PML體作為ROS和氧化損傷的傳感器，也可以作為細(xì)胞衰老的非廣譜性的生物標(biāo)志物。
表2 衰老相關(guān)分泌表型成分 脂質(zhì)對于細(xì)胞膜的完整性、能量的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都是必不可少的。一些與衰老相關(guān)疾病會影響脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。雖然衰老細(xì)胞以脂質(zhì)代謝變化為標(biāo)志，但尚不清楚這一過程是如何產(chǎn)生衰老表型的（圖1）。在衰老過程中，線粒體功能紊亂可能導(dǎo)致ROS驅(qū)動的脂質(zhì)損傷、脂質(zhì)沉積以及和脂褐質(zhì)的積累。除了氧化作用外，在衰老細(xì)胞中也有脂質(zhì)衍生的醛類修飾（如4-羥基-2-壬烯醛[4-HNE]）的相關(guān)報道。衰老細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積可以用各種商業(yè)化的染料和檢測手段進(jìn)行檢測，也可以使用免疫染色法觀察脂質(zhì)相關(guān)蛋白（如perilipin 2）鑒定。值得注意的是，對肥胖和衰老小鼠衰老細(xì)胞的基因編輯或藥物清除可以減少脂質(zhì)在肝臟和大腦中的沉積。盡管細(xì)胞衰老與脂質(zhì)積累密切相關(guān)，但我們對其中特定脂質(zhì)代謝物成分的知之甚少。脂肪酸及其前體和磷脂分解代謝物（如二十碳五烯酸酯（Eicosapentaenoate,EPA）、丙二酸酯、7-羥基-3-氧基-4-膽甾烯酸酯（7- HOCA）以及1-硬脂酰甘油磷酸肌醇）在衰老的成纖維細(xì)胞中有所增加，而亞油酸酯、二同型亞油酸酯和10-十七烯酸酯則相對減少。此外，還伴隨有游離膽固醇的增多，源自醋酸酯中的磷脂和膽固醇酯的減少以及脂肪酸合酶和硬脂酰CoA去飽和酶-1含量的下降。盡管目前已經(jīng)有一些檢測組織和細(xì)胞中脂質(zhì)變化的方法，然而由于衰老相關(guān)脂質(zhì)譜的高度變異性，這些指標(biāo)作為衰老生物標(biāo)志物的應(yīng)用十分受限。（例如，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物在致癌基因誘導(dǎo)的衰老和復(fù)制性衰老之間就存在顯著差異。）衰老細(xì)胞在線粒體功能、動力學(xué)和形態(tài)上表現(xiàn)出多種改變。衰老細(xì)胞中的線粒體功能減弱，表現(xiàn)為膜電位降低、質(zhì)子泄漏增加、融合和分裂率降低、質(zhì)量增加和三羧酸（Tricarboxylic Acid, TCA）循環(huán)代謝物種類增加。雖然衰老細(xì)胞中線粒體的數(shù)量可能逐漸增加，但它們產(chǎn)生ATP的能力似乎受到了損害。相比之下，雖然衰老細(xì)胞線粒體的呼吸功能受到損傷，但是其會產(chǎn)生更多能引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷的ROS（參見“蛋白質(zhì)損傷”和“脂質(zhì)損傷”），同時ROS還會導(dǎo)致端粒的縮短以及DDR的活化。在線粒體生物學(xué)方面，如電子傳遞鏈（Electron Transport Chain, ETC）、復(fù)合物I組裝、線粒體裂變率、生物發(fā)生、線粒體去乙?；?或TCA周期的中斷都可以導(dǎo)致衰老。衰老過程中AMP : ATP和ADP : ATP比值的改變通過激活A(yù)MPK（AMP-激活蛋白激酶，可以感應(yīng)能量損失），而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。衰老過程中的線粒體功能障礙也與SASP調(diào)控有關(guān)。衰老細(xì)胞中的線粒體自噬（線粒體清除）可能對SASP也存在抑制作用。即使在缺乏關(guān)鍵促炎SASP因子（如IL-6和IL-8）表達(dá)的細(xì)胞中，對ETC的遺傳或藥理抑制仍可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。。NAD+/NADH比值在衰老細(xì)胞中降低，這會使聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly-ADP Ribose Polymerase, PARP）和sirtuins的活性發(fā)生改變，這兩者都參與了SASP調(diào)控因子NF-κB的激活。雖然大量的數(shù)據(jù)支持在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，線粒體功能的變化在衰老方面發(fā)揮著重要作用，但在體內(nèi)是否一致尚不清楚。雖然線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的小鼠模型出現(xiàn)了衰老進(jìn)程加深的表型，但線粒體在體內(nèi)的衰老細(xì)胞中的功能還沒有進(jìn)行過詳細(xì)的描述。因為線粒體功能障礙同時也存在于其他細(xì)胞過程，它并非僅屬于細(xì)胞衰老的特異性標(biāo)記。最后，在衰老和與衰老相關(guān)疾病中，衰老細(xì)胞是否導(dǎo)致線粒體功能受損尚不清楚。分泌需要同時激活合成和分解代謝過程（見“分泌表型”章節(jié)）。溶酶體趨向于分解代謝過程，因為這一過程水平的提高會提供能量和原料，溶酶體是吞噬作用、內(nèi)吞作用和自噬進(jìn)行降解的最終地點。溶酶體的生物發(fā)生是受轉(zhuǎn)錄驅(qū)動并取決于細(xì)胞的能量或降解需求。有趣的是，當(dāng)溶酶體腔內(nèi)氨基酸水平較高時會引發(fā)mTOR1的募集和激活，反之亦然。此外，溶酶體與線粒體相互作用能保持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定（見“線粒體”章節(jié)）。衰老細(xì)胞中的溶酶體數(shù)量和大小均有增加，通過顯微鏡可以看到明顯的胞質(zhì)顆粒。逐漸增多累積的功能失調(diào)的溶酶體可能會試圖使細(xì)胞通過產(chǎn)生更多的新溶酶體來平衡。因此，合成和分解代謝之間的平衡，對分泌至關(guān)重要。致癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程里，這種平衡在TOR自噬空間耦聯(lián)間隔（TOR-Autophagy Spatial-Coupling Compartment, TASCC，高爾基體反側(cè)的一個細(xì)胞間隔，能夠協(xié)調(diào)SASP因子的產(chǎn)生）中得到維持。溶酶體內(nèi)容物的增加并不一定等同于其活性增加，因為溶酶體的內(nèi)容物在自噬的降解階段也是減少的。因此，溶酶體-線粒體軸降解，導(dǎo)致線粒體更新減少，從而增加ROS的產(chǎn)生。隨后，ROS作用于包括溶酶體在內(nèi)的各細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形成一個惡性循環(huán)，產(chǎn)生更多的損傷。溶酶體質(zhì)量的增加與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性（衰老生物標(biāo)志物）有關(guān)。然而，盡管SA-β-gal在衰老細(xì)胞中顯著存在，但它既不是衰老表型的必需因素，也不是衰老表型的決定因素。從治療的角度來看，溶酶體室的擴(kuò)大提供了一個更大的能力來捕獲可質(zhì)子化的藥物，比如CDK4/6抑制劑帕博西尼（palbociclib）、瑞博西尼（ribociclib）和?，斘髂幔╝bemaciclib）。這種能力雖然降低了這些藥物在胞漿和細(xì)胞核中的有效濃度，但由于溶酶體中藥物會緩慢釋放，藥物暴露時間反而有所延長。另一個與溶酶體功能異常相關(guān)的衰老特征是脂褐素聚合體在溶酶體內(nèi)的富集（見“蛋白損傷”和“脂質(zhì)損傷”章節(jié)）。有趣的是，脂褐素被報道可刺激抗凋亡因子BCL-2的表達(dá)，使細(xì)胞具備凋亡抗性，這是衰老細(xì)胞的另一個特征。衰老細(xì)胞中的溶酶體也參與細(xì)胞染色質(zhì)片段加工（CCFs）。（見“DNA損傷”與“分泌表型”章節(jié)）衰老相關(guān)表觀遺傳學(xué)和基因表達(dá)的變化 上述特征與基因表達(dá)的變化息息相關(guān)，由編碼和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控決定，可用于細(xì)胞衰老的檢測。在這里，我們關(guān)注這些在細(xì)胞衰老進(jìn)程中影響顯著的基因表達(dá)的變化，并介紹一個可以幫助辨別與衰老相關(guān)的基因的新數(shù)據(jù)庫，名為“SeneQuest”。盡管表觀遺傳修飾發(fā)生在細(xì)胞衰老過程中，但其主要還是依賴于環(huán)境因素。例如，復(fù)制性衰老一直與CpG位點的DNA甲基化完全喪失有關(guān)。此外，細(xì)胞衰老還會導(dǎo)致某些CpG島DNA甲基化的局部增加。有趣的是，這種DNA甲基化譜在某種程度上與癌癥和個體衰老相關(guān)的甲基化模式類似，而經(jīng)歷了OIS的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出這種DNA甲基化的改變，以上現(xiàn)象均增加了衰老過程中表觀遺傳的多樣性。衰老細(xì)胞在整體上也表現(xiàn)出染色質(zhì)開放性增加，但全基因組圖譜因微環(huán)境中刺激的不同也會發(fā)生變化。個體組蛋白修飾和變異在衰老過程中會發(fā)生改變。例如，H4K16ac在細(xì)胞衰老過程中經(jīng)常在活性啟動子處富集，但在增殖過程中則并非如此。它的積累與組蛋白變異體H3.3密切相關(guān)，組蛋白變異體H3.3通過HIRA/UBN1/CABIN1和ASF1a分子伴侶以獨立于DNA復(fù)制的方式沉積到染色質(zhì)中。值得注意的是，H3.3的N端蛋白裂解與細(xì)胞衰老過程中不同基因亞群的基因抑制相關(guān)。連接蛋白H1的整體缺失是另一個細(xì)胞衰老的特征。某些組蛋白修飾在衰老進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用，如H4K20me3和H3K9me3的上調(diào)會阻遏增殖，而基因增強(qiáng)子區(qū)域H3K27ac水平的上調(diào)則促進(jìn)SASP的發(fā)生。衰老也與染色質(zhì)形態(tài)變化有關(guān)。衰老相關(guān)的異染色質(zhì)病灶（Senescence-Associated Heterochromatin Foci, SAHFs，通過DAPI染料染色密集區(qū)域能夠可視化）富含異染色質(zhì)蛋白（HP）1。SAHFs來源于染色質(zhì)因子（包括RB、組蛋白變異體macroH2A、高遷移率A族蛋白、HIRA/UBN1/CABIN1和ASF1a分子伴侶）并會增加核孔密度。人們最初認(rèn)為SAHFs會參與基因調(diào)控。然而，隨后的研究表明SAHFs中大部分是晚期復(fù)制的基因，即使在增殖細(xì)胞中也是如此，這表明SAHFs在衰老相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮的作用很小。衰老也與連接組蛋白H1的整體丟失有關(guān)。值得注意的是，由于SAHFs并不存在于所有衰老細(xì)胞中，因此它們似乎是細(xì)胞類型和刺激依賴性的。也因此，SAHFs可有助于細(xì)胞衰老的鑒定，而其功能意義尚待闡明。另一個染色質(zhì)特征（稱為衰老相關(guān)衛(wèi)星膨脹（Senescence-Associated Distension Of Satellites, SADSs））體現(xiàn)為著絲粒及其周圍異染色質(zhì)的致密度降低。SADSs先于SAHFs的形成，可能與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。轉(zhuǎn)座子是另一種與衰老有關(guān)的構(gòu)成性異染色質(zhì)。通常被處于的LINE-1（L1）的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子被激活，刺激cGAS-STING通路，引起Ⅰ型干擾素反應(yīng)（見“分泌表型”章節(jié)）。因此，除了導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性外，這些元素還會刺激SASP產(chǎn)生。核纖層的主要成分層核纖層蛋白B1的下調(diào)是細(xì)胞衰老的另一個重要特征。核纖層蛋白B1的丟失與表觀遺傳學(xué)特征以及與衰老相關(guān)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（SAHFs和SADSs）有關(guān)。它的減少主要發(fā)生在富含H3K9me3的區(qū)域，這一過程會將H3K9me3從核膜上釋放出來，促進(jìn)H3K9me3異染色質(zhì)的空間重排形成SAHFs。OIS的Hi-C分析（染色質(zhì)構(gòu)象的全基因組圖譜分析技術(shù)）顯示H3K9me3和核纖層蛋白B1富集區(qū)域的局部連接性降低，干擾了這些長距離的相互作用。另一方面，復(fù)制性衰老表現(xiàn)為染色體內(nèi)長距離相互作用的喪失和近程相互作用的增加，這意味著衰老相關(guān)的高秩序性的染色質(zhì)相互作用是依賴于外界刺激和環(huán)境的。此外，核纖層蛋白B1的丟失和核完整性的降低可能通過促進(jìn)CCF的形成來促進(jìn)SASP產(chǎn)生，從而刺激cGAS-STING途徑和干擾素反應(yīng)（見“分泌表型”章節(jié)）。自噬介導(dǎo)的CCF形成和組蛋白合成減少也可能導(dǎo)致核心組蛋白在衰老過程中的全部丟失，影響染色質(zhì)形態(tài)。衰老表型與衰老類型的驗證常使用細(xì)胞周期停滯相關(guān)及SASP相關(guān)的幾個基因，并結(jié)合其他生物標(biāo)志物（圖1）。例如，細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶的抑制物CDKN1A （p21WAF1/Cip1）, CDKN2A （p16INK4A）, CDK2B （p15INK4B） 和部分SASP基因表達(dá)量的增加，以及細(xì)胞周期蛋白CCNA2, CCNE2和LMNB1表達(dá)量的下降。此外，應(yīng)當(dāng)建立假定衰老細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，然后將其與不斷增加的現(xiàn)有衰老轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較。全轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)被作為工具應(yīng)用于主要信號通路研究，涉及衰老表型的建立， 特定條件下藥物靶點的預(yù)測。例如，近年的一項研究中，在癌基因誘導(dǎo)，復(fù)制誘導(dǎo)或DNA損傷誘導(dǎo)三種不同條件分別誘導(dǎo)的不同類型衰老細(xì)胞中，相同的13個基因受到差異調(diào)控。最近，一項只涉及成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的相似研究，也試圖定義衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征。雖然當(dāng)前缺乏衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，但許多單細(xì)胞研究（可用于評估人群內(nèi)部差異）正在進(jìn)行。因此，幾年內(nèi)這些衰老相關(guān)基因特征可能將會發(fā)生改變。但是，最終在多種條件的體外培養(yǎng)下及體內(nèi)的實驗中，將會證明衰老基因表達(dá)的特征對于鑒定衰老是有價值的。非編碼RNA，特別是miRNA（microRNA, miRNA），可以單獨或協(xié)同影響細(xì)胞衰老進(jìn)程。miRNA功能研究揭示了幾個miRNA直接或間接調(diào)控關(guān)鍵衰老效應(yīng)因子p53, p21WAF1/Cip1和SIRT1的豐度。miR-504靶向p53的3’UTR, 降低p53豐度與活性。同樣地，Gld2介導(dǎo)miR-122的穩(wěn)定，使其能夠結(jié)合CBEP 3’UTR, 從而導(dǎo)致p53 mRNA聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄降低。相反地，miR-605靶向的MDM2啟動p53介導(dǎo)的衰老，并且多個miRNA下調(diào)p21WAF1/Cip1，包括阻斷OIS的28個miRNA。同樣，miR-24在細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎疾病模型中抑制p16INK4A。復(fù)雜的miRNA反饋環(huán)路可以調(diào)節(jié)衰老進(jìn)程。例如，p53/miRNA/CCNA2通路獨立于p53/p21WAF1/Cip1調(diào)控衰老。相似地，p53依賴性的上調(diào)miR34a/b/c可以下調(diào)細(xì)胞增殖與存活因子。非編碼RNA也能調(diào)控SASP。例如，在誘導(dǎo)衰老后的數(shù)周，miR-146a/b增加并抑制SASP促進(jìn)炎癥的通路。miRNA也可以下調(diào)衰老的抑制因子，包括多梳蛋白（Polycomb Group, PcG）家族成員CBX7, EED, EZH2和SUZ12 （miR-26b, 181a, 210和424），導(dǎo)致p16INK4A的抑制解除，促進(jìn)衰老。最后，miRNA在衰老中的作用超出了其經(jīng)典功能。例如，在細(xì)胞核中Argonaute 2 （AGO2）結(jié)合let-7f，再與RB1形成一個復(fù)合物pRB，導(dǎo)致CDC2和CDCA8啟動子上的染色質(zhì)抑制。這些E2F靶基因的沉默是啟動衰老所必要的。長鏈非編碼RNA （Long non-coding RNAs, lncRNAs）能夠結(jié)合RNA，DNA或蛋白質(zhì)來調(diào)控衰老。例如，ANRIL是一個長30-40kb由CDKN2A位點編碼的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其可以結(jié)合CBX7抑制INK4B/ARF/INK4A的表達(dá)。同樣地，lncRNA PANDA通過招募PcG復(fù)合物抑制衰老啟動基因。然而，p53響應(yīng)lncRNA GUARDIN的沉默則會造成細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡。相比之下，在RAF誘導(dǎo)OIS之后，lncRNA VAD通過減少抑制性的H2A.Z在INK啟動子上的積累來維持衰老。同樣，lncRNA UCA1干擾RNA結(jié)合蛋白hnRNP A1與p16INK4A的結(jié)合，但不會干擾與p14ARF的結(jié)合及其轉(zhuǎn)錄。另外，以miRNA為重點的非編碼RNA分析提出了一個衰老特征。有趣的是，衰老細(xì)胞釋放的小胞外囊泡中miRNA含量隨著時間的推移而變化。衰老蛋白標(biāo)記物的研究始于OIS。除了已知的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白外，一些研究還發(fā)現(xiàn)DCR2也是衰老的一個常見標(biāo)志物，后來證明它標(biāo)記了另一種類型的細(xì)胞衰老。DCR2是一種死亡誘餌受體，其可以保護(hù)衰老細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡，從而阻斷對衰老細(xì)胞的免疫監(jiān)視。相似地，自然殺傷（Natural Killer, NK）細(xì)胞激活受體（NKG2D）的配體MICA和ULBP2促進(jìn)復(fù)制誘導(dǎo)，OIS誘導(dǎo)和DNA損傷誘導(dǎo)的衰老。細(xì)胞表面標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)具有特殊的意義，因為利用這些標(biāo)志物，可以對組織中分離的衰老細(xì)胞進(jìn)行定量，分離以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析。然而，DCR2和NKG2D配體在物種間并不保守，因此小鼠與人類之間不能進(jìn)行比較。最近，又發(fā)現(xiàn)兩種上調(diào)的細(xì)胞表面標(biāo)記物，分別是在OIS中的Notch1和在復(fù)制及OIS中的DPP4。兩種蛋白對SASP都具有調(diào)節(jié)作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了一種可作為衰老標(biāo)志物的氧化形式的膜結(jié)合Vimentin蛋白，通過適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可靶向表達(dá)該蛋白的細(xì)胞。最后，衰老細(xì)胞可能是通過增加抗凋亡BCL-2家族成員的表達(dá)來抵抗凋亡。研究者們利用熒光素酶或熒光蛋白作為報告基因，開發(fā)出一些轉(zhuǎn)基因小鼠來評估p16INK4A在體內(nèi)或體外的表達(dá)。研究者們通過對熒光素酶活性的縱向測定發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增加，p16INK4A的表達(dá)量及動物間的個體差異性也隨之增加，分離熒光標(biāo)記的p16陽性細(xì)胞可以進(jìn)行表型分析。這種方法可以讓內(nèi)源性的p16INK4A啟動子來驅(qū)動信號，但是會導(dǎo)致p16的雜合狀態(tài)。另一種小鼠（p16-3MR）使用熒光素酶（rLUC），單體紅色熒光蛋白（monomeric Red Fluorescent Protein, mRFP）和胸苷激酶（Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase, HSV-TK）的融合蛋白來進(jìn)行構(gòu)建，細(xì)菌人工染色體上的p16INK4A啟動子驅(qū)動整合到小鼠基因組中的該融合蛋白。這種方法能夠檢測并殺死衰老細(xì)胞，且不擾亂內(nèi)源的CDKN2A位點。最后，INK-ATTAC小鼠表達(dá)由p16INK4A啟動子驅(qū)動的FKBP-Caspase8融合蛋白及增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP），識別并殺死p16陽性細(xì)胞。盡管這些小鼠之間存在著差異，但它們在證明衰老細(xì)胞導(dǎo)致多種衰老相關(guān)疾病方面有著其自身價值。由p21WAF1/Cip1啟動子驅(qū)動的熒光素酶和eGFP的小鼠也可以用于此方面研究。研究人員已經(jīng)開發(fā)出一些早衰小鼠模型以模擬人類早衰綜合癥，包括DNA修復(fù)缺陷和基因組完整性缺陷。早衰小鼠衰老更加快速，壽命更短，這便于研究衰老細(xì)胞在個體衰老中的作用及測試衰老治療藥物。例如，在BubR1H/H早衰小鼠中，研究人員通過敲除細(xì)胞中的p16INK4A減緩了衰老相關(guān)的衰退癥狀，首次證明了衰老細(xì)胞與某些衰老表型間有因果關(guān)系。BubR1對于有絲分裂中紡錘體組裝檢查點非常重要。BubR1H/H小鼠僅表達(dá)正常水平10% 的BubR1，其異倍性，早衰特征及器官中的衰老標(biāo)志物表達(dá)均表現(xiàn)出上調(diào)。從BubR1H/H -INK-ATTAC小鼠中選擇性清除p16INK4A陽性細(xì)胞可改善駝背，白內(nèi)障及肌肉萎縮，但不能改善心律失常和動脈壁硬化，也不能延長壽命。相似地，Ercc1-/Δ早衰小鼠由于存在DNA修復(fù)缺陷，衰老細(xì)胞在其很多組織中加速積累，使其過早地患上多種衰老相關(guān)疾病。Ercc1-/Δ小鼠僅表達(dá)正常水平5%的對核苷酸切除、鏈間交聯(lián)和雙鏈斷裂修復(fù)都非常重要的核酸內(nèi)切酶ERCC1-XRF。研究人員使用衰老細(xì)胞清除藥物治療Ercc1-/Δ小鼠可減少其衰老標(biāo)志物的表達(dá)，并延長其壽命。兒童早衰癥（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS），是由破壞lamin A加工的突變引起的一種部分或組織特異性的早衰癥。LMNA突變或缺失的小鼠會出現(xiàn)類似HGPS的表型。通過SA-β-gal染色和衰老標(biāo)志物的mRNA水平檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)在它們的骨骼肌和心臟中也會積累衰老細(xì)胞。這些衰老細(xì)胞積累的部位與衰老相關(guān)的病理和疾病部位一致。類似地，在進(jìn)行了LMNA剪接突變的HGPS小鼠模型中，研究人員觀察到了肝臟與腎臟的衰老。然而，研究人員還未證明衰老細(xì)胞是HGPS的致病誘因。由Xpd基因中一個特殊突變造成的毛狀體營養(yǎng)不良（Trichothiodystrophy, TTD）小鼠模型也表明衰老細(xì)胞在早衰中發(fā)揮著作用。在XpdTTD/TTD小鼠中，細(xì)胞衰老在驅(qū)動個體衰老中的作用已經(jīng)通過FOXO4的D逆轉(zhuǎn)錄（DRI-）亞型肽治療能夠干擾FOXO4與p53的互作這一事實所清楚地證明。研究人員使用FOXO4-DRI肽治療XpdTTD/TTD小鼠，降低了小鼠的嗜睡癥狀，改善了小鼠的皮毛密度，轉(zhuǎn)棒實驗?zāi)芰蛯Υ碳さ姆磻?yīng)情況。小鼠體內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, Sod1）的缺失也會加速衰老。Sod1-/-小鼠腎臟中氧化性DNA損傷增加，衰老相關(guān)蛋白（p16INK4A, p21WAF1/Cip1）及SASP因子（IL-1b, IL-6）表達(dá)量均增加，SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)量增多，衰老相關(guān)疾病的發(fā)生也增加了。但是，迄今為止，還沒有研究人員在Sod1-/-小鼠中證明細(xì)胞衰老驅(qū)動疾病的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制性因子NFKB1亞基缺失可誘導(dǎo)小鼠早衰。這些小鼠表現(xiàn)出慢性低度炎癥，并由此導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生了各方面的衰老表型與較早死亡。然而，與一些廣泛使用的早衰小鼠模型相比，這些小鼠的最大壽命仍能達(dá)到20個月。此外，這些小鼠在多個組織中的衰老細(xì)胞均增加。最后，SAMP1-3 和 SAMP6-11小鼠是由于選擇性近親繁殖AKR/J小鼠所構(gòu)建的早衰小鼠品系（Senescence-Accelerated Mouse, SAMP）。盡管這些小鼠衰老進(jìn)程加速，可以用于檢測衰老治療藥物，但目前尚不清楚哪些基因突變在這些品系中驅(qū)動衰老。在體內(nèi)，衰老細(xì)胞存在于各種組織中。由于SASP它們對于組織的作用可能是局部的，也可能是全方面的。為了理解衰老如何影響組織功能，組織重塑和衰老，我們需要工具來識別組織中的衰老細(xì)胞。大多數(shù)組織都可以進(jìn)行單細(xì)胞分析。常用的技術(shù)包括免疫染色、原位雜交和多色（成像）流式細(xì)胞術(shù)。甚至更多的標(biāo)記物可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測（通過移動時間進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)[Cytometry by Time-Of-Fligh, [CYTOF]）。這些方法雖然很有作用，但也存在著空間關(guān)聯(lián)信息丟失和不同類型細(xì)胞（包括衰老細(xì)胞和非衰老細(xì)胞）分離效率差異的限制。因此，顯微成像仍然是原位衰老檢測的首選方法。如前所述，目前還沒有針對衰老細(xì)胞的絕對特異性的單一標(biāo)記物。標(biāo)記的特異性因細(xì)胞類型，組織，機(jī)體發(fā)育階段，物種和其他因素而異。但是，一些標(biāo)記具有更普遍的有效性，而另一些則與特定的衰老類型有關(guān)。因此，我們建議使用一種結(jié)合更廣泛和更特異的標(biāo)記的多標(biāo)記方法，更準(zhǔn)確地在原位檢測衰老細(xì)胞（圖3）。
圖3.多標(biāo)記檢測衰老細(xì)胞方法的三步工作流程。擬定的工作流程的第一步是檢測衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）或脂褐質(zhì)的積累量（SBB試劑或GL13試劑）。第二，與在衰老細(xì)胞中常見的標(biāo)志物（p16INK4A, p21WAF1/Cip1）及缺失的標(biāo)志物（增殖標(biāo)志物，laminB1）共染色。第三，確定在特定的衰老環(huán)境中可能改變的因素。這種多標(biāo)記的衰老檢測方法能夠以最高的精度識別衰老細(xì)胞。 在人體內(nèi)檢測衰老細(xì)胞的挑戰(zhàn) 從細(xì)胞水平的研究來說，衰老對于人類疾病的作用顯而易見，但是體內(nèi)研究的證據(jù)現(xiàn)在才剛剛開始出現(xiàn)。OIS最初是細(xì)胞培養(yǎng)中被發(fā)現(xiàn)的第一個在人體內(nèi)得到驗證的衰老類型。在人體內(nèi)，小鼠的腫瘤前病灶及原發(fā)或治療過的腫瘤中，均證實了腫瘤抑制因子缺失會導(dǎo)致OIS或衰老。后來，關(guān)于衰老分泌體的多種報道（見“分泌表型”章節(jié)），使人們對其致瘤特性有所認(rèn)識，建立了現(xiàn)在公認(rèn)的衰老在致癌過程中的雙重作用。最近，有證據(jù)表明衰老與其他常見的衰老相關(guān)疾病存在著關(guān)聯(lián)。這些疾病包括神經(jīng)退行性疾病，青光眼，白內(nèi)障，動脈粥樣硬化等心血管疾病，糖尿病，骨關(guān)節(jié)炎，肺、腎和肝纖維化。在大多數(shù)研究中，衰老是通過體外培養(yǎng)或新鮮樣本的SA-β-gal染色或甲醛固定組織的間接標(biāo)記來評估的。由于SA-β-gal不適用于固定組織，因此分析人體樣品的衰老具有挑戰(zhàn)性。脂褐素是衰老細(xì)胞的另一特征，組織化學(xué)染料SBB可與脂褐素相互作用。脂褐素能夠保存在固定的材料中并可被修復(fù)。它是從21萬年前的人類化石中分離出來的。最近開發(fā)的一種試劑（GL13）可用于免疫組化并能檢測出預(yù)測預(yù)后不良的霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphomas, HL）中衰老的霍奇金和里德-斯特恩伯格（Hodgkin and Reed-Sternberg, HRS）細(xì)胞。這些細(xì)胞體積巨大，并有一個大且偶爾伴隨小葉狀的核（細(xì)胞周期終止的跡象），分泌活動增加，處在炎癥環(huán)境中，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈反映衰老表型特征的組織學(xué)特征（圖1）。另一種體內(nèi)鑒定并定量衰老細(xì)胞的方法是結(jié)顯微成像流式細(xì)胞術(shù)分析的SA-β-gal染色。盡管每種標(biāo)記物在衰老的檢測上都有很好的結(jié)果，但并不是所有的衰老模型中都會同時表達(dá)這些標(biāo)記物。我們建議結(jié)合細(xì)胞質(zhì)（如SA-β-gal，脂褐素），細(xì)胞核（如p16INK4A，p21WAF1/Cip1，Ki67），SASP，環(huán)境及細(xì)胞特異性的標(biāo)志物來綜合分析（圖3）。大約60年前，Hayflick和他的同事首次對細(xì)胞衰老進(jìn)行了描述，在了解衰老細(xì)胞的特征和功能方面取得了重大進(jìn)展。衰老研究的限制仍然是缺乏具體的標(biāo)志物，特別是對于研究生物而言。我們建議使用多標(biāo)記物的方法來克服這一障礙（圖3）。該策略還可用于評估清除衰老細(xì)胞療法的功效。清除衰老細(xì)胞療法是一種新興的治療方法，最近進(jìn)入臨床試驗，用于各種衰老相關(guān)疾病的治療。從概念上講，衰老是一個非線性、多變量的 [F（x,y）=z] 函數(shù)，其中的因變量z（結(jié)果）取決于自變量x（刺激）和y（環(huán)境）。非線性過程由動態(tài)遺傳和表觀遺傳過程決定，這些過程可能導(dǎo)致重新編程的循環(huán)直到達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)為止。初看，結(jié)果似乎是細(xì)胞周期停滯和生物活性分子的分泌。然而，最近的證據(jù)表明細(xì)胞周期停滯并不總是一個必然的結(jié)果。因為有絲分裂后的細(xì)胞已經(jīng)不能增殖，呈現(xiàn)出類似衰老的特征。但在一定條件下，衰老細(xì)胞可以重新進(jìn)入細(xì)胞周期。SASP是一種衰老常見的特征，但它是高度多樣化的。因此，要了解衰老細(xì)胞的多效性表型，需要從傳統(tǒng)的還原論轉(zhuǎn)向更系統(tǒng)的、多參數(shù)的方法。開發(fā)復(fù)雜的高通量方法和能夠處理多組數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)工具，將有助于實現(xiàn)這一目標(biāo)。盡管“舊”與“新”各有利弊，但我們可以結(jié)合最佳方法來分析衰老表型的“深淵”。這種方法可能會揭示更具體的與衰老相關(guān)的特征，以解決重要的未解之謎：什么引發(fā)并調(diào)節(jié)了SASP？遺傳決定因素和表觀遺傳決定因素如何與刺激和細(xì)胞微環(huán)境相互作用？哪些基因組修復(fù)系統(tǒng)在不同的衰老情況下發(fā)揮功能？什么導(dǎo)致細(xì)胞逃逸生長停滯？“逃逸”的衰老細(xì)胞具有怎樣的表型？這些問題和其他問題的解答將有助于為每種亞型的衰老建立特定的標(biāo)志物組（見圖3第3步），并指導(dǎo)衰老治療領(lǐng)域的發(fā)展，從而在精準(zhǔn)醫(yī)療中實現(xiàn)最佳效果。原文：Vassilis Gorgoulis, Peter D. Adams, Andrea Alimonti et al., CellularSenescence: Defining a Path Forward, Cell, 179 （2019）. 責(zé)編：王思 排版：陸小炮
“老頑童說”致力于傳播衰老及相關(guān)疾病的科研進(jìn)展和趣味科普，解讀衰老背后的科學(xué)故事。
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