研究者：蘇敏， 張瑋， 朱成凱， 張峰， 諸葛宇征

研究機(jī)構(gòu)：南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子（TWEAK）是一個(gè)Ⅱ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，F(xiàn)n14是目前發(fā)現(xiàn)的TWEAK唯一的受體，TWEAK/Fn14信號(hào)通路在促炎、血管再生以及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等過(guò)程中都發(fā)揮著廣泛的作用。

TWEAK/Fn14在一些肝損傷模型中可起到促進(jìn)作用，故而可能促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程，但該通路在肝纖維化過(guò)程中的具體作用機(jī)制，尤其是在活化HSC的遷徙方面的作用尚不清楚。

正常情況下，HSC位于Disse腔內(nèi)，胞漿中有含類視黃醇物質(zhì)的脂滴，當(dāng)各種病理因素作用下HSC由靜止?fàn)顟B(tài)被激活，活化的HSC發(fā)生細(xì)胞形態(tài)、增殖、代謝和功能的變化，同時(shí)細(xì)胞的遷徙特性也增加。HSC遷徙是肝纖維化形成過(guò)程中所必須的，HSC遷徙缺陷時(shí)，在致纖維化因素下很少發(fā)生肝纖維化。HSC的遷徙能力增加導(dǎo)致炎癥區(qū)域活化的HSC數(shù)目顯著增多，直接參與損傷修復(fù)。

同時(shí)活化的HSC也向肝內(nèi)更廣泛的區(qū)域移行，加速ECM沉積，從而導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域的擴(kuò)散，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過(guò)加入TWEAK及干擾TWEAK受體Fn14的方法驗(yàn)證了TWEAK/Fn14信號(hào)通路能增加LX-2細(xì)胞遷徙能力。增強(qiáng)HSC遷徙能力的分子機(jī)制目前尚不清楚，既往研究報(bào)道與細(xì)胞形態(tài)、骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子等多種因素相關(guān)。

MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，以無(wú)活性的酶原形式從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，經(jīng)過(guò)一系列的酶聯(lián)反應(yīng)被激活而發(fā)揮生物學(xué)作用。在肝纖維化中，MMP9被發(fā)現(xiàn)與肝損傷及炎癥反應(yīng)程度存在相關(guān)性，在非酒精性脂肪性肝病及丙型肝炎患者中尤為明顯。

有研究顯示MMP9與HSC遷徙密切相關(guān)，MMP9被激活后發(fā)揮蛋白水解作用降解膠原成分，從而促進(jìn)HSC遷徙；同時(shí)MMP9還能激活TGFβ，后者作為經(jīng)典的促肝纖維化細(xì)胞因子，不僅具有強(qiáng)大的促進(jìn)HSC增殖的能力，還能大大增強(qiáng)HSC的遷徙能力。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TWEAK/Fn14通路可以上調(diào)MMP9的表達(dá)水平，其表達(dá)量隨著TWEAK作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且下調(diào)Fn14后再加入TWEAK處理，MMP9的表達(dá)量下降，因此TWEAK/Fn14信號(hào)通路增強(qiáng)HSC的遷徙能力，考慮是由于升高M(jìn)MP9的水平導(dǎo)致。并且由于TWEAK促炎作用是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程的基礎(chǔ)。

real-time PCR檢測(cè)干擾Fn14基因后mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，3條干擾序列都能降低Fn14 mRNA的表達(dá)水平，其中第2條序列的干擾效果最好，下降（0.163±0.001）倍。同時(shí)蛋白水平也顯示第2條序列的干擾效果最佳，所以選擇第2條序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

分別檢測(cè)加入TWEAK后0、3、6、12及24 h，MMP9的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化情況。結(jié)果顯示，加入TWEAK后MMP9的mRNA水平明顯升高，其中3 h升高（1.27±0.25）倍，6 h升高（2.37±0.25）倍,12 h升高（5.02±0.22）倍,24 h升高（8.55±0.03）倍。同時(shí)MMP9蛋白水平也隨著TWEAK作用時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增加

將陰性對(duì)照及轉(zhuǎn)染過(guò)Fn14 siRNA的LX-2細(xì)胞分別加入TWEAK處理，檢測(cè)MMP9的mRNA及蛋白水平表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，si#2+TWEAK組MMP9的mRNA表達(dá)量較陰性對(duì)照+TWEAK組降低，下降（0.81±0.04）倍。同時(shí)si#2+TWEAK組MMP9蛋白水平也較陰性對(duì)照+TWEAK組降低