肝臟在各種致病因素持續(xù)損傷下反復(fù)發(fā)生纖維化，正常的肝組織被瘢痕和再生結(jié)節(jié)所取代，最終形成肝硬化。肝硬化也是慢性肝病的常見終末期表現(xiàn)，2012年全球致死病因排名中，肝硬化排第14位。肝移植被認(rèn)為是肝硬化最有效的治療方案，但因供體不足、經(jīng)費(fèi)較高、免疫排斥等原因，大多數(shù)肝硬化患者并未進(jìn)行肝移植。

近年來(lái)多項(xiàng)研究報(bào)道了自體骨髓干細(xì)胞（BMSC）參與了肝功能的修復(fù)和重建，但具體機(jī)制并不清楚。自體BMSC抗纖維化作用已在動(dòng)物模型中得到明確證實(shí)。此外，臨床試驗(yàn)也表明自體BMSC移植能迅速改善肝功能，且無(wú)明顯副作用。但目前開展的自體BMSC治療肝硬化的臨床試驗(yàn)并不多，也沒(méi)有統(tǒng)一的治療方案。因此本文將從自體BMSC治療肝硬化的機(jī)制、BMSC輸入通路、療效評(píng)估指標(biāo)、細(xì)胞輸入劑量等方面進(jìn)行綜述。

1  BMSC治療肝硬化機(jī)制  

BMSC治療肝硬化的機(jī)制目前認(rèn)為主要有兩種：一是功能性肝細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，二是通過(guò)旁分泌改善微環(huán)境。

1.1  功能性肝細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化

BMSC進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)后，在微環(huán)境的刺激下一方面可分化為肝臟卵圓細(xì)胞，另一方面可直接分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞。肝臟卵圓細(xì)胞是Farber在研究肝癌的病理變化時(shí)所發(fā)現(xiàn)，因細(xì)胞呈卵圓形而被命名為卵圓細(xì)胞。成年人肝臟中卵圓細(xì)胞極少，主要分布在門靜脈周圍，處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到致病因素刺激時(shí)，本身存在的肝臟卵圓細(xì)胞和新分化生成的卵圓細(xì)胞因微環(huán)境發(fā)生改變和細(xì)胞因子的刺激，可分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等。Goff等發(fā)現(xiàn)BMSC可分化成肝卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞，并且這些由BMSC分化而來(lái)的卵圓細(xì)胞表面表達(dá)了造血干細(xì)胞的CD34、Thy-1等標(biāo)志。Oh等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Lange等發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子后可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Aziz等將大鼠BMSC經(jīng)尾靜脈注入肝纖維化大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSC在大鼠體內(nèi)可分化為肝樣細(xì)胞，且大鼠肝纖維化得到明顯改善。

1.2  旁分泌作用

BMSC進(jìn)入肝臟后，不論是發(fā)生細(xì)胞分化還是發(fā)揮抗肝纖維化作用，都離不開各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的參與。這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可激活肝祖細(xì)胞，從而抑制星狀細(xì)胞激活并促進(jìn)其凋亡，抑制損傷部位炎癥的相關(guān)細(xì)胞增殖和遷移等。目前發(fā)現(xiàn)參與旁分泌作用的因子主要有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、IL-10等。每種細(xì)胞因子和介質(zhì)的作用各不相同，彼此之間相互協(xié)調(diào)，共同參與抗纖維化作用。比如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子有保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、加速肝功能恢復(fù)等作用?；|(zhì)金屬蛋白酶則主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道提高基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)可增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，改善小鼠肝功能并減輕肝纖維化。Sun等將體外培養(yǎng)的BMSC注入肝纖維化小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝纖維化明顯改善，且小鼠體內(nèi)IL-10表達(dá)明顯升高。

2  BMSC輸入通道

臨床上BMSC治療肝硬化時(shí)，細(xì)胞輸入通道主要包括肝動(dòng)脈、門靜脈、外周靜脈、肝內(nèi)或脾內(nèi)注射。

2.1  肝動(dòng)脈

肝動(dòng)脈分為左右兩支，血液從腹腔干經(jīng)肝動(dòng)脈直接進(jìn)入肝內(nèi)。臨床上肝動(dòng)脈由于其重要的解剖原因，主要用于肝臟腫瘤介入治療的通路。在自體BMSC治療肝硬化中，肝動(dòng)脈也可作為細(xì)胞注入的通路。Walczak等研究表明肝動(dòng)脈輸注有助于BMSC的歸巢，靜脈注射BMSC后，BMSC首先進(jìn)入肺部，然后進(jìn)入肝臟。在這個(gè)過(guò)程中干細(xì)胞可能被毛細(xì)血管組織中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，外周注射干細(xì)胞后，干細(xì)胞成像信號(hào)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱。Zhao等的一項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞治療肝病的薈萃分析結(jié)果顯示，經(jīng)肝動(dòng)脈輸注干細(xì)胞更利于患者肝功能的改善。Laio等在應(yīng)用BMSC治療肝硬化的臨床試驗(yàn)中，選擇經(jīng)肝動(dòng)脈輸注干細(xì)胞，結(jié)果顯示干細(xì)胞治療組的患者在治療后12周血清Alb、TBil等多項(xiàng)指標(biāo)得到明顯改善。

2.2  門靜脈

門靜脈是肝門重要的脈管結(jié)構(gòu)，胃腸道血液回流至腸系膜上靜脈后匯入門靜脈內(nèi)。在超聲引導(dǎo)下穿刺門靜脈，可直接注入干細(xì)胞，而且避開了肺部循環(huán)。Salama等在研究中對(duì)90例肝硬化患者進(jìn)行超聲引導(dǎo)下經(jīng)門靜脈注入干細(xì)胞，術(shù)后患者未發(fā)生肝門部膽管損傷、出血等并發(fā)癥。試驗(yàn)結(jié)果表明門靜脈輸注BMSC后能明顯改善肝硬化患肝功能。但由于肝硬化患者靜脈血流阻力增高，疾病晚期常伴有門靜脈高壓，若直接穿刺門靜脈需考慮出血風(fēng)險(xiǎn)。

2.3  外周靜脈

外周靜脈是臨床治療時(shí)應(yīng)用最為廣泛的輸注通道，其操作簡(jiǎn)單方便，普通病房即可完成，且并發(fā)癥少。因此外周靜脈也可以作為BMSC輸注通路之一。同肝動(dòng)脈輸注相比，外周靜脈需要先經(jīng)過(guò)肺部循環(huán)，因此療效受到一定的削減。Mohamadnejad等的一項(xiàng)自體BMSC治療肝硬化的隨機(jī)對(duì)照研究中，試驗(yàn)組患者均通過(guò)肘部靜脈輸注自體BMSC，結(jié)果表明經(jīng)外周靜脈輸注BMSC后可以一定程度改善患者肝功能。

2.4  肝內(nèi)或脾內(nèi)注射

除了上述通路外，也有學(xué)者提出將干細(xì)胞直接注入肝臟或脾臟內(nèi)。國(guó)內(nèi)外已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明直接經(jīng)脾臟或肝臟注射干細(xì)胞可以改善肝功能。黃增輝等將肝干細(xì)胞直接注入急性肝損傷的小鼠脾臟內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝損傷得到明顯改善。張麗霞等將BMSC注入肝硬化小鼠的脾臟內(nèi)，移植4周后小鼠肝臟病理切片顯示硬化程度減輕，膠原纖維及壞死面積減少，組織結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)。Amer等在一項(xiàng)40人參與的病例對(duì)照研究中，試驗(yàn)組20人予以BMSC治療，其中10人經(jīng)脾臟內(nèi)注射干細(xì)胞，其余10人則行肝內(nèi)注射。結(jié)果顯示經(jīng)兩種途徑治療后，肝硬化患者Alb和終末期肝病模型（MELD）評(píng)分得到了明顯改善。作者指出兩種途徑在療效上并無(wú)差異，但經(jīng)脾臟注射操作更加方便。

3  BMSC輸入劑量 

自體BMSC治療肝硬化的有效性已得到臨床試驗(yàn)的證實(shí)，但關(guān)于治療時(shí)干細(xì)胞輸注劑量沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外臨床試驗(yàn)在輸入劑量選擇上也沒(méi)有明確提出理論依據(jù)。目前開展的自體BMSC治療肝硬化的臨床試驗(yàn)中使用的干細(xì)胞輸注劑量大致呈三個(gè)梯度，分別是BMSC≤5×10^7、5×10^7＜BMSC≤ 4×108和BMSC＞4×10^8。Suk等在一項(xiàng)BMSC治療肝硬化的臨床隨機(jī)對(duì)照研究中，選擇經(jīng)肝動(dòng)脈輸注5×10^7個(gè)BMSC，結(jié)果顯示患者ALT、AST、TBil、Alb治療前后改善程度在試驗(yàn)組和對(duì)照組間無(wú)明顯差異。Salama等在BMSC治療肝硬化時(shí)，向患者輸注5×10^7個(gè)BMSC，治療前后患者Alb、ALT、AST、TBil得到明顯改善。Amer等向肝硬化患者肝內(nèi)或皮內(nèi)直接注射2×10^8個(gè)BMSC，治療后隨訪顯示肝硬化患者治療前后Alb和MELD評(píng)分得到了明顯改善。Laio等在進(jìn)行自體BMSC治療肝硬化的研究時(shí)，經(jīng)肝動(dòng)脈注入（9.08±1.77）×10^8個(gè)BMSC，結(jié)果顯示干細(xì)胞治療后患者ALT、AST、TBil、Alb得到了明顯改善。吳玉卓等在應(yīng)用自體BMSC治療乙型肝炎失代償期肝硬化患者時(shí)，經(jīng)肝動(dòng)脈向患者肝內(nèi)注入（1~11）×10^8個(gè)BMSC，經(jīng)過(guò)24周隨訪發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療后患者ALT、AST、TBil得到明顯改善，并且患者的1年生存率得到提高。

4  療效評(píng)估指標(biāo) 

對(duì)于干細(xì)胞治療肝硬化療效評(píng)估，需要多項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷，其中以肝功能和凝血功能相關(guān)指標(biāo)應(yīng)用最為廣泛。肝功能指標(biāo)主要包括ALT、AST、TBil、Alb、MELD評(píng)分、Child-Pugh評(píng)分等。凝血功能指標(biāo)主要包括凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、凝血酶原濃度（PC）、凝血酶原時(shí)間（PT）和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）。由于肝硬化的本質(zhì)就是肝臟反復(fù)纖維化的結(jié)果，因此不論是代表肝臟合成功能的Alb，還是體現(xiàn)肝細(xì)胞受損程度的AST和ALT，都可直接評(píng)估治療效果。另外肝臟是人體內(nèi)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等合成的主要場(chǎng)所，因此凝血功能的變化可間接評(píng)估治療效果。Salama等在BMSC治療后隨訪中觀察了肝硬化患者Alb、ALT、AST、TBil、PC的變化，結(jié)果表明在治療后第12周，所有指標(biāo)均得到明顯改善。Suk等一項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞治療肝病的研究表明INR治療前后的變化在干細(xì)胞治療組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。

除上述指標(biāo)外，臨床上也有學(xué)者選擇肝纖譜、肝臟體積、脾臟體積、肝臟儲(chǔ)備功能、血常規(guī)、功能狀態(tài)評(píng)分、疲勞量表、炎癥因子等作為評(píng)估指標(biāo)。Mohamadnejad等在BMSC治療肝硬化后的第48周通過(guò)CT測(cè)量并統(tǒng)計(jì)干細(xì)胞治療組和對(duì)照組患者肝臟體積的變化，發(fā)現(xiàn)兩組之間無(wú)明顯差異。Amer等在研究中向終末期肝病患者輸注骨髓來(lái)源的肝樣細(xì)胞，治療后8周隨訪發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干細(xì)胞治療的肝病患者M(jìn)ELD評(píng)分、Child-Pugh評(píng)分、功能狀態(tài)評(píng)分和疲勞量表得到明顯改善。吳玉卓等發(fā)現(xiàn)BMSC治療可明顯改善患者Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原蛋白。Bai等在自體BMSC治療肝硬化的病例對(duì)照研究中隨訪了患者白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療后的第24周，干細(xì)胞治療組的白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板得到明顯改善。黃麗雯等對(duì)31例終末期肝病患者進(jìn)行干細(xì)胞治療的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，患者在治療前及治療后12周分別行吲哚菁綠清除試驗(yàn)評(píng)估肝臟儲(chǔ)備功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療后患者的肝臟儲(chǔ)備功能得到明顯改善。Xu等研究發(fā)現(xiàn)BMSC治療后的肝硬化患者血清中IL-6和IL-7明顯低于對(duì)照組患者。

5  其他

5.1  BMSC動(dòng)員

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是由174個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。G-CSF是目前應(yīng)用最多的干細(xì)胞動(dòng)員劑?；A(chǔ)研究表明皮下注射G-CSF一方面能夠動(dòng)員BMSC，使BMSC與基質(zhì)細(xì)胞的黏附作用被打破，利于BMSC的純化和收集；另一方面G-CSF可促進(jìn)大量干細(xì)胞入血，增加了干細(xì)胞的療效。Liu等進(jìn)行了一項(xiàng)BMSC治療失代償肝硬化的臨床研究，在患者進(jìn)行干細(xì)胞移植前予以皮下注射G-CSF，治療后第4周隨訪顯示得到改善的指標(biāo)包括ALT、AST、Alb、TBil、PT。

G-CSF皮下注射在增加BMSC濃度的同時(shí)，同樣可誘發(fā)外周血白細(xì)胞異常升高，發(fā)生“類白血病”反應(yīng)。肝硬化患者本身大多存在凝血障礙、肝功能異常、脾功能亢進(jìn)等，皮下注射G-CSF可能導(dǎo)致患者臨床癥狀加重，甚至發(fā)生休克、脾破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥。王迪等對(duì)51例失代償期肝硬化患者連續(xù)2 d給予G-CSF動(dòng)員BMSC，注射劑量為4 μg·kg-1·d-1。連續(xù)監(jiān)測(cè)患者外周血常規(guī)，發(fā)現(xiàn)患者白細(xì)胞明顯升高，最高達(dá)正常值4.5倍，部分患者出現(xiàn)輕微腹痛、發(fā)熱，但沒(méi)有患者發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。

5.2  BMSC提取

目前BMSC提取方式主要是通過(guò)骨髓穿刺，抽出的BMSC通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增再進(jìn)行移植。臨床上3個(gè)主要穿刺部位分別是髂前上棘、髂后上棘和胸骨。胸骨因其后為大血管，穿刺風(fēng)險(xiǎn)較高而不常用。髂前上棘骨皮質(zhì)較厚，骨面不平整，骨質(zhì)較硬，進(jìn)針困難，且髂前上棘毗鄰腹腔，若穿刺針滑脫易穿入腹腔，導(dǎo)致腹腔感染或腸道穿孔等。Peng等在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中選擇髂前上棘行骨髓穿刺，所有穿刺患者術(shù)后未發(fā)生腹腔臟器損傷及感染。髂后上棘骨面較平，進(jìn)針較容易，不與重要臟器緊鄰，該處穿刺創(chuàng)傷小、易愈合。Bai等、Xu等在自體BMSC治療肝病的臨床試驗(yàn)中，均選擇髂后上棘作為穿刺部位，患者穿刺術(shù)后僅出現(xiàn)穿刺點(diǎn)疼痛，無(wú)其余并發(fā)癥，予以對(duì)癥處理后均好轉(zhuǎn)。

BMSC通常通過(guò)直接骨穿刺獲得，但值得注意的是，外周循環(huán)血細(xì)胞篩選也可以獲得骨髓干細(xì)胞。Tayeb等對(duì)肝硬化患者行G-CSF干細(xì)胞動(dòng)員后，直接通過(guò)外周血行干細(xì)胞分離和收集，將收集的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行干細(xì)胞治療。

6  總結(jié)及展望

自體BMSC在治療肝硬化上取得了一定成果。同臍帶干細(xì)胞、肝干細(xì)胞相比，自體BMSC方便獲取、體外易培養(yǎng)擴(kuò)增、無(wú)免疫排斥，可作為肝移植的替代療法。但在臨床實(shí)際應(yīng)用BMSC時(shí)仍存在許多問(wèn)題，如：（1）BMSC治療肝硬化的機(jī)制涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，目前具體機(jī)制并不清楚；（2）對(duì)于治療中BMSC輸注的劑量問(wèn)題，并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；（3）自體BMSC作為肝移植的替代療法，部分患者移植干細(xì)胞后癥狀和評(píng)估指標(biāo)得以改善，但對(duì)于BMSC療效持續(xù)時(shí)間目前并不清楚；（4）BMSC對(duì)肝硬化的療效已得到證實(shí)，但對(duì)BMSC二次或者多次治療的時(shí)間問(wèn)題上缺乏相關(guān)研究報(bào)道；（5）臨床研究中不論肝硬化患者是否接受干細(xì)胞動(dòng)員，采集的干細(xì)胞均可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并且接受動(dòng)員劑的同時(shí)有可能誘發(fā)其他并發(fā)癥，因此自體骨髓干細(xì)胞提取前是否需要予以干細(xì)胞動(dòng)員仍需討論；（6）雖然自體BMSC移植在眾多臨床研究中沒(méi)報(bào)道過(guò)嚴(yán)重并發(fā)癥，但干細(xì)胞本身具備分化功能，在肝硬化患者復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境中，其有可能發(fā)生異常增生，甚至發(fā)生惡變。總體來(lái)說(shuō)，自體BMSC移植治療肝硬化目前并沒(méi)有統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。但對(duì)于無(wú)法得到肝移植的晚期肝硬化患者而言，自體BMSC移植是不錯(cuò)的替代療法。