你的單抗雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)不出抗體，不妨試試基因工程抗體

基因工程抗體的概念比較廣

本文僅僅討論怎么從雜交瘤細(xì)胞株開始做基因工程抗體

主要解決如下幾個(gè)問題：

1.    知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的需要，給細(xì)胞株建立指紋身份；

2.    更容易發(fā)文章；

3.    序列比細(xì)胞株更容易保存；

4.    對(duì)于不容易從腹水或者培養(yǎng)制備抗體的細(xì)胞株換個(gè)思路

5.    人源化抗體的需求

6.    嵌合抗體潛在需要

從雜交瘤細(xì)胞株做單克隆抗體，主要解決分三大步驟：

1.    雜交瘤細(xì)胞株測(cè)序

測(cè)序的方法主要有兩種，

1)兼并引物設(shè)計(jì)（degenerate primer）分別擴(kuò)增抗體重連和輕鏈的可變區(qū)

2)RACE法，RACE即cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)( rapid amplification of cDNA ends),是一種基于逆轉(zhuǎn)錄PCR從樣本中快速擴(kuò)增cDNA的5′端及3'端的技術(shù)

方法1）更加的節(jié)約成本，便捷高效；但是很多的實(shí)驗(yàn)室不掌握核心的兼并引物設(shè)計(jì)方法，只能選擇RACE方法。

2.    載體構(gòu)建

分別構(gòu)建重鏈和輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)載體的選擇和元件優(yōu)化組合尤為重要，除了大家認(rèn)為密碼子優(yōu)化問題，還有載體的信號(hào)肽選擇尤為重要，這個(gè)決定抗體的表達(dá)水平，一般優(yōu)先選擇V5信號(hào)肽，當(dāng)抗體產(chǎn)量不高的時(shí)候也可以試試其他的信號(hào)肽，篩選最優(yōu)；當(dāng)然載體的抗體的骨架選擇也是需要注意的。

3.    共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)

抗體的表達(dá)一般選用HKE293或者CHO細(xì)胞系，好用的細(xì)胞系一般都是商業(yè)化公司壓箱底至寶，不會(huì)輕易流出，其配套的轉(zhuǎn)染試劑和培養(yǎng)基也是經(jīng)過特殊優(yōu)化的，培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染試劑是可以公開出售的。

進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)，必須要1.2.0*10^6以上的雜交瘤細(xì)胞，越純?cè)胶茫浑s交瘤細(xì)胞株測(cè)序的難點(diǎn)在于基于PCR的引物對(duì)的設(shè)計(jì)，很多實(shí)驗(yàn)室沒有這個(gè)技術(shù)，按照文獻(xiàn)發(fā)表的序列重復(fù)，往往也效果不好；這個(gè)時(shí)候可以委托專業(yè)化公司幫忙。

基因工程表達(dá)抗體的益處：

長(zhǎng)期做單抗的實(shí)驗(yàn)室都知道，經(jīng)常遇到雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生抗體能力越來越弱或者抗體效價(jià)越來越低，主要原因可能是抗體基因發(fā)生突變，因此早期測(cè)序留住抗體基因尤為重要，對(duì)于規(guī)模化生產(chǎn)單抗的均一性更為重要。

現(xiàn)在很多的公司或者實(shí)驗(yàn)室推出所謂的抗體氨基酸測(cè)序，目前這個(gè)技術(shù)不是很成熟，相對(duì)于抗體基因測(cè)序也不夠精確?？贵w氨基酸測(cè)序一般是把抗體的重鏈和輕鏈去糖基化，再用蛋白酶切斷，通過質(zhì)譜鑒定，然后計(jì)算機(jī)拼接，這里面的難點(diǎn)：1.算法不一定科學(xué)；2.質(zhì)譜鑒定中區(qū)分亮氨酸/異亮氨酸相對(duì)困難。