引 言

三聚氰胺(Melamine，圖1a)，化學(xué)名為2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，主要用作生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料，這種樹脂被廣泛運(yùn)用于木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業(yè);三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等［1］。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而常規(guī)的“凱氏定氮法”檢測食品或飼料中蛋白質(zhì)含量時不能排除這類“偽蛋白氮”的干擾，因而一些不法分子為降低成本，在牛奶、奶粉和飼料添加這種非食品性化工原料，以提高其產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。2008年10月，我國制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2．5mg/kg。

目前，檢測三聚氰胺的主要方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，這些方法雖然準(zhǔn)確度高，但樣品預(yù)處理復(fù)雜、設(shè)備昂貴，檢測費(fèi)用高。近年來，酶聯(lián)免疫吸附法］以及膠體免疫層析試劑條等已用于三聚氰胺的檢測，但仍存在靈敏度不夠高或特異性不夠強(qiáng)等不足。本研究對三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較合理的修飾，合成了兩種三聚氰胺衍生物，并分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白相連制得免疫原和包被抗原。利用雜交瘤抗體制備技術(shù)得到抗三聚氰胺的單克隆抗體，以所制得的抗體為基礎(chǔ)，建立了測定牛奶、奶粉、飼料中三聚氰胺的膠體金免疫層析法。

2 實驗部分

2． 1 儀器與試劑

UV-2300型紫外-可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司);Dura12FV純水機(jī)(美國THELAB公司);SunriseRemote酶標(biāo)儀和M12/2R洗板機(jī)(奧地利Tecan公司);硝酸纖維素膜(Whatman公司)，底板，吸水紙，玻璃纖維素膜(上海杰一生物有限公司);三聚氰胺(成都長征化學(xué)試劑有限公司);

檸檬酸三鈉，氯金酸，二甲亞砜(上海國藥有限公司);牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、雞卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、酪蛋白、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，'5，5，'-tetramethylbenzidine，TMB)、二環(huán)己基碳二亞胺(N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuc-ci-nimide，NHS)和二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)均購自美國Sigma公司;羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(2-Chloro-4，6-diamino-1，3，5-triazine，CAAT，比利時AcrosOrganics公司);三聚氰酸、三聚氰氯(上海國藥有限公司);環(huán)丙氨嗪(浙江國邦醫(yī)藥有限公司);阿特拉津(浙江中山化工有限公司)。其余試劑均為分析純。

2． 2 實驗方法

2．2．1三聚氰胺衍生物的制備本研究對三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較合理的修飾，制備了兩種三聚氰胺衍生物。衍生物1(分子結(jié)構(gòu)如圖1b):稱取CAAT加入反應(yīng)瓶，用無水甲醇溶解，再加入對氨基苯甲酸(溶于KOH-無水甲醇中);反應(yīng)回流5～12h，直到CAAT反應(yīng)完全;反應(yīng)混合物過濾，并用無水乙醇和蒸餾水各洗3次，得到白色粗產(chǎn)物;再用甲醇-二氯甲烷過柱，得到純品。衍生物2(分子結(jié)構(gòu)如圖1c所示)的制備過程與制備衍生物1相同，但溶劑為無水乙醇，衍生試劑為3-巰基丙酸。

2．2．2免疫原和包被抗原的制備分別稱取衍生物1(或衍生物2)和DCC、NHS，共溶于DMF中，室溫下攪拌過夜，將混合液離心5～20min，取上層清液，緩慢加入到0．01%～0．02%的BSA(或OVA)中，攪拌1～10h，離心分離，取上層清液，透析4～5d，溶液冷凍干燥，置冰箱中存放，其中，衍生物1-BSA為免疫原，衍生物2-OVA為包被抗原。

2．2．3單克隆抗體的制備抗三聚氰胺的單克隆抗體由雜交瘤技術(shù)制備［15］。經(jīng)免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，細(xì)胞培養(yǎng)、篩選等過程，篩選出能分泌抗三聚氰胺抗體的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，用硫酸銨沉淀法純化腹水中的單克隆抗體，純化抗體與等體積甘油11混合，并置于"20保存。

2．2．4膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金［16］:稱取1g氯金酸，溶于100mL水中，配成1%氯金酸溶液。取1mL1%氯金酸溶液，加入裝有100mL沸騰的超純水的圓底燒杯中。繼續(xù)加熱攪拌，快速加入2．5mL1%檸檬酸三鈉溶液。當(dāng)溶液的顏色變?yōu)橥该鞯木萍t色時，加熱5min后，停止加熱。冷卻至室溫，用補(bǔ)充至原體積。4貯存?zhèn)溆谩?/span>

2．2．5膠體金標(biāo)記單克隆抗體取100mL膠體金溶液，用0．1mol/LK2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液至pH7．0～9．0，緩慢加入400μL飽和硫酸銨純化的1．45mg/mL單克隆抗體，繼續(xù)攪拌30min。在4中靜置2h后，邊攪拌邊逐滴加入BSA封閉劑，持續(xù)攪拌10min后，4放置過夜。金標(biāo)抗體溶液常溫低速離心，棄去沉淀。取紅色上清溶液于低溫高速(14000r/min)離心40min。取管底可流動的暗紅色沉淀，用PB溶液(0．02mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7．4，含一定濃度的蔗糖，BSA和吐溫-20)將沉淀混懸為原體積的1/10，4保存?zhèn)溆谩?/span>

2．2．6膠體金免疫層析試劑條的組裝、檢測及結(jié)果判定在2．5cm×0．5cm的玻璃纖維素膜上噴涂用PB溶液稀釋的30μL金標(biāo)抗體，37干燥2h，即為膠金墊。將包被抗原(1g/L)和羊抗鼠IgG(稀釋比為150)在硝酸纖維素膜(NC)上點(diǎn)樣，分別作為檢測線(T)和質(zhì)控線(C)，室溫干燥。取出一塊底板，將噴有T線和C線的硝酸纖維素膜粘貼在中央?yún)^(qū)，分別將吸水紙和膠金墊粘貼于硝酸纖維素膜的上方和下方。兩者之間重疊約2mm，再在膠金墊的下方粘貼噴有緩沖溶液的玻璃纖維素膜作為樣品墊，組裝成膠體金免疫層析試劑條，如圖2a所示。

100μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(或樣品試液)于樣品墊中，溶液將沿吸水紙方向移動。首先與膠金墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合，并一同繼續(xù)向吸水紙方向移動，到達(dá)T線區(qū)域。在T線處，溶液中的三聚氰胺與包被抗原競爭金標(biāo)抗體，溶液中的三聚氰胺濃度越大，能夠與包被抗原相結(jié)合的金標(biāo)抗體的量越少，膠體金的顏色(紅色)越淺，通過比對顏色的深淺從而判斷三聚氰胺的含量。當(dāng)金標(biāo)抗體到C線區(qū)域，將與羊抗鼠IgG結(jié)合，故在C線處總會出現(xiàn)膠體金的顏色(紅色)。整個檢測過程僅需10min就可完成。

膠體金免疫層析法的結(jié)果判定(圖2b):當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶，判定為陰性;當(dāng)檢測線無紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，判定為陽性;當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均未出現(xiàn)紅色條帶或只有T線有紅色條帶，試劑條無效。

2．2．7樣品采集、預(yù)處理及檢測從當(dāng)?shù)厥袌錾腺彽门Ｄ?/span>(樣1、樣2)，奶粉和飼料(雞、豬)3種樣品，經(jīng)簡單的樣品處理后用所制備的免疫層析條檢測。

樣品處理:(1)牛奶:取1mL牛奶，加入1mL樣品稀釋液(0．02mol/LPBS，含0．5%吐溫-20，pH7．4)稀釋。(2)奶粉:取1g奶粉，倒入50mL離心管中，加入10mL去離子水，渦旋2min，取1mL混合的牛奶樣品至5mL離心管中，用1mL的樣品稀釋液稀釋。(3)飼料:碾磨均勻，取1g至5mL離心管中，加入2mL甲醇-水(23，V/V)，渦旋2min，7500g離心5min，取上清液100μL至1mL離心管中，加入300μL樣品稀釋液。

取 100 μL 樣品試液于樣品墊中，10 min 后觀察 T 線和 C 線中顏色( 紅色) 的深淺作判定。

3 結(jié)果與討論

3． 1 三聚氰胺衍生物的制備

在衍生物1(圖1b)中，三聚氰胺原有分子結(jié)構(gòu)保留較完整，且連接橋為苯基，這種修飾方式將使所制備的免疫原具有更強(qiáng)的免疫原性，且產(chǎn)生的抗體特異性將得到提高。在衍生物2(圖1c)中，1位上的N被S所取代，且連接橋為直鏈，將使抗體與包被抗原的結(jié)合力減弱，從而提高檢測的靈敏度。

3． 2 膠體金納米顆粒的表征

膠體金納米顆粒的粒徑大小與膠體金探針穩(wěn)定性密切相關(guān)。用紫外-可見分光光度計可以測出膠體金納米顆粒的最大吸收波長。從圖3a可見，合成的不同批次的膠體金其最大吸引波長幾乎沒有變化，即λmax均為520nm。從透射電子顯微鏡(TEM)照片(圖3b)可見，膠體金的平均粒徑為18nm，符合膠體金免疫層析法中膠體金顆粒粒徑大小的要求。

3． 3 免疫層析試劑條檢測三聚氰胺的檢出限

配制濃度為0，0．1，1，10，100和1000μg/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。取100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品墊中，10min后觀察結(jié)果(圖4)。隨著三聚氰胺的濃度升高，在C線區(qū)膠體金顏色(紅色)強(qiáng)度較大，并且無明顯變化，但在T線區(qū)膠體金顏色(紅色)強(qiáng)度逐漸降低，在1μg/L時T線顏色明顯變淺，而在10μg/L時T線顏色基本消失。若將T線顏色基本(或完全)消失所對應(yīng)的濃度定義為膠體金免疫層析法的檢出限，則可判定本研究所制備的三聚氰胺試紙條的檢出限為10μg/L，遠(yuǎn)低于國家所制訂的三聚氰胺的限量值，也低于文獻(xiàn)［14，15］報道的檢出限，表明制備的三聚氰胺試紙條靈敏度高。

3．4免疫層析試劑條檢測三聚氰胺的特異性

選取了10種物質(zhì)(CAAT、三聚氰氯、三聚氰酸、環(huán)丙氨嗪、阿特拉津、鹽酸克倫特羅、氯霉素、吡蟲啉、林可霉素和左旋-18-甲基炔諾酮)進(jìn)行特異性實驗，前5種物質(zhì)均含有三嗪類物質(zhì)的分子骨架，為三聚氰胺的類似物。將這10種物質(zhì)均配成濃度為1000μg/L的溶液，并取100μL溶液于樣品墊中，10min后觀察結(jié)果(圖5)。從圖5a可見，1000μg/LCAAT和環(huán)丙氨嗪可使T線顏色基本(或完全)消失，即與10μg/L三聚氰胺所產(chǎn)生的C線顏色變淺(甚至消失)的效果相當(dāng)，因此CAAT和環(huán)丙氨嗪與三聚氰胺試紙條的交叉反應(yīng)率(CR)約為1%。從圖5還可見，1．0μg/L其它8種物質(zhì)用三聚氰胺試紙條檢測，T線顏色與C線顏色基本相近，表明其它8種物質(zhì)與三聚氰胺試紙條均無交叉反應(yīng)，說明制備的三聚氰胺試紙條不僅靈敏度高，而且特異性強(qiáng)。

3． 5 加標(biāo)樣品的檢測

對牛奶樣1，牛奶樣2、奶粉、雞飼料和豬飼料進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗。牛奶樣品的加標(biāo)濃度為0．5，2．0和4．0mg/L，奶粉和飼料的加標(biāo)濃度為0．5，2．0和4．0μg/g。加標(biāo)樣品預(yù)處理后，稀釋200倍，使樣品稀釋后的最終濃度為2．5，10和20μg/L。取100μL樣品液加入樣品中，10min后觀察結(jié)果。樣品稀釋液同時用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)進(jìn)行檢測。表1為兩種方法對加標(biāo)樣品的測定結(jié)果。從表1可見，試劑條的檢測結(jié)果與ELISA的檢測結(jié)果相一致。

3． 6 免疫層析試劑條的穩(wěn)定性

將所制備的試劑條裝入充有氮?dú)?/span>和放有干燥劑的小袋中，4密封保存150d，檢測0μg/L濃度的三聚氰胺，結(jié)果T線的顏色與當(dāng)天做的試劑條T線的顏色一致，表明試劑條穩(wěn)定性良好。

本研究合成了兩種三聚氰胺衍生物，分別用于制備免疫原和包被抗原，并利用雜交瘤抗體制備技術(shù)得到抗三聚氰胺的單克隆抗體，建立了靈敏度、特異性強(qiáng)、簡單、快速的測定三聚氰胺的膠體金免疫層析法，可用于食品和飼料中三聚氰胺的快速檢測。