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解螺旋公眾號(hào)·陪伴你科研的第2007天 β-Actin與GAPDH內(nèi)參真的那么靠譜嗎？免疫印跡（Western blot, WB）是分子生物學(xué)中檢測(cè)復(fù)雜生物提取物中特定蛋白質(zhì)存在的最常用方法之一。WB必須控制上樣量以確保目標(biāo)蛋白變化具有可比性，通常選擇在所有組織中普遍分布的具有相對(duì)恒定量的蛋白質(zhì)作為內(nèi)參（Loading control）。 內(nèi)參與其上樣量應(yīng)該如何確定？哪種內(nèi)參最靠譜？ 文獻(xiàn)報(bào)道總蛋白上樣量超過(guò)10 μg時(shí)內(nèi)參蛋白不夠敏感，無(wú)法檢測(cè)到差異：所以一般情況下內(nèi)參的理想上樣量為大約5μg。對(duì)于目標(biāo)蛋白的上樣量，其理想的上樣量為為10-20μg：GAPDH是一種定位于細(xì)胞質(zhì)的常用內(nèi)參，使用HeLa細(xì)胞裂解液上樣10-50μg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同上樣量GAPDH幾乎無(wú)變化：為了測(cè)試上述發(fā)現(xiàn)是否為普遍現(xiàn)象，將HzAm1細(xì)胞裂解液（覆蓋了WB分析中的大部分蛋白質(zhì)）上樣4-40μg，PVDF膜ECL顯色結(jié)果驚奇的發(fā)現(xiàn)上樣總蛋白質(zhì)超過(guò)4μg時(shí)β-Actin條帶無(wú)明顯增加：為了達(dá)到數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的目的，現(xiàn)在諸多SCI期刊審稿人要求每個(gè)目標(biāo)蛋白條帶同一張膜上均需孵育內(nèi)參。然而，從上述β-Actin與GAPDH的結(jié)果來(lái)看我們有理由懷疑這一要求的合理性！因此我們使用抗TCTP（翻譯控制的腫瘤蛋白）抗體和抗GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）抗體用于評(píng)估這一廣泛接受的做法。結(jié)果顯示TCTP與GSK-3β信號(hào)強(qiáng)度隨著上樣量增加幾乎成線性關(guān)系，而此時(shí)β-Actin隨著上樣量增加幾乎無(wú)變化：因此，上述結(jié)果說(shuō)明使用β-Actin重新探測(cè)相同的膜以達(dá)到數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的目的的傳統(tǒng)做法應(yīng)該受到質(zhì)疑。那么為什么會(huì)出現(xiàn)上述現(xiàn)象呢？這種現(xiàn)象可歸因于β-Actin的豐度，β-Actin豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞中的大多數(shù)其他蛋白質(zhì)。結(jié)果導(dǎo)致β-Actin經(jīng)常超載，特別是在檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)時(shí)無(wú)法區(qū)分蛋白質(zhì)上樣量的差異。為了確認(rèn)β-Actin的適用范圍，在低于4μg的范圍內(nèi)連續(xù)稀釋樣品進(jìn)行分析（方形折線為理論含量，圓形折線為實(shí)際檢測(cè)情況）：結(jié)果顯示在在0.7-1.9μg范圍內(nèi)，β-Actin的條帶強(qiáng)度逐漸增加，這與蛋白質(zhì)上樣量非常匹配。在2.2-40μg的總蛋白范圍內(nèi)沒(méi)有觀察到β-Actin明顯的條帶強(qiáng)度變化，以上結(jié)果說(shuō)明隨著上樣量在該范圍內(nèi)的增加，實(shí)際值和理論值之間的差異變得越來(lái)越顯著。例如，當(dāng)總蛋白上樣量增加到40μg時(shí)，其差異超過(guò)10倍。針對(duì)上述問(wèn)題有人提出了一些解決方法，例如使用麗春紅染色（Ponceau staining）或考馬斯亮藍(lán)染色（Coomassie staining）替代β-Actin進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)然也有文獻(xiàn)這么做，例如：麗春紅染色和考馬斯亮藍(lán)染色作為內(nèi)參的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于單個(gè)蛋白質(zhì)作為內(nèi)參，因此消除了特定條件下單個(gè)管家蛋白的變化的影響。然而這些方法仍然存在許多問(wèn)題，麗春紅染色總蛋白的光密度值近似線性高達(dá)140μg，馬斯亮藍(lán)染色高達(dá)20μg，然而，實(shí)際蛋白上樣量遠(yuǎn)高于理論值，這將縮小甚至減小樣品之間蛋白質(zhì)水平的倍數(shù)變化。此外，由于麗春紅染色強(qiáng)度的高度時(shí)間依賴性染色和考馬斯亮藍(lán)染色的硝化纖維素膜上的高背景，復(fù)現(xiàn)性差也降低了它們作為內(nèi)參的吸引力。Stain-free總蛋白定量是一種新興的總蛋白歸一化方法，該方法通過(guò)直接對(duì)每一條泳道的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行定量避免了各種內(nèi)參的局限性。與麗春紅染色和考馬斯亮藍(lán)染色相比，Stain-free總蛋白定量結(jié)果更接近理論值，因此強(qiáng)烈推薦此方法！在此我們使用Stain-free總蛋白定量方法來(lái)定量大鼠心臟勻漿中的總蛋白，結(jié)果表明Stain-free總蛋白定量準(zhǔn)確反映了每個(gè)通道中的蛋白質(zhì)量，可作為WB的可靠?jī)?nèi)參：上圖Stain-Free?免染膠購(gòu)自Bio-Rad公司，有興趣的朋友可以自行查找。接下來(lái)對(duì)WB檢測(cè)到的蛋白酶體亞基Rpt1的進(jìn)行歸一化，歸一化后Rpt1無(wú)變化：肝臟裂解物(10-45μg) Stain free gel使用紫外活化2分鐘后與麗春紅S染色液相比Stain free法定量更加準(zhǔn)確：值得注意的是Stain free轉(zhuǎn)膜后的NC膜成像時(shí)必須在濕潤(rùn)條件下進(jìn)行，否則獲得的圖像質(zhì)量明顯較差：綜上所述，內(nèi)參抗體在線性范圍內(nèi)才能夠很好的反應(yīng)蛋白上樣量，因此上樣量無(wú)論對(duì)于內(nèi)參還是目標(biāo)蛋白均很重要。Stain-free總蛋白定量方法由于其準(zhǔn)確性與便捷性，可作為我們WB內(nèi)參定量的金標(biāo)準(zhǔn)！希望今天的分享對(duì)大家有所幫助，謝謝大家！參考文獻(xiàn)： 1. Chen, W. & Xu, W. H. β-Actin as a loading control: Less than 2 μg of total protein should be loaded. Electrophoresis 36, 2046–2049 (2015). 2. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics 17, (2017). 3. Gilda J.E., Gomes A.V. (2015) Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Stain-Free Technology. In: Posch A. (eds) Proteomic Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1295. Humana Press, New York, NY. 4. Gilda, J. E. & Gomes, A. V. Stain-Free total protein staining is a superior loading control to b-actin for Western blots. Analytical Biochemistry 440, 186–188 (2013). 點(diǎn)下“在看”，多根頭發(fā)
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