大分子溶液比普通溶液粘度大,線形大分子又比球形大分子粘度大。DNA是線形大分子,人類DNA分子平均長(zhǎng)度在4 cm以上,而雙螺旋直徑只有2 nm,長(zhǎng)度直徑比高達(dá)千萬數(shù)量級(jí)。因此,DNA粘度極高,也極易在機(jī)械力作用下折斷。雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA時(shí),由較伸展的雙螺旋變成較緊湊的線團(tuán)結(jié)構(gòu),粘度明顯下降。RNA因?yàn)榉肿恿啃?,且呈線團(tuán)結(jié)構(gòu),所以其粘度低得多。 不同大分子的浮力密度也不同。DNA一般在1.7以上,RNA為1.6,蛋白質(zhì)為1.35-1.40。分子量相同結(jié)構(gòu)不同的DNA沉降系數(shù)不同,線形雙螺旋DNA、線形單鏈DNA、超螺旋DNA沉降系數(shù)之比為1:1.14:1.4。所以可用利用密度梯度離心分離核酸。氯化銫溶解度高,可制成高密度溶液,所以最為常用。要求不高時(shí),也可用蔗糖等。 ![]() 密度梯度離心,引自百度圖片 嘌呤和嘧啶因具有共軛體系而有強(qiáng)紫外吸收。核酸在260nm有紫外吸收峰,蛋白質(zhì)在280nm。利用紫外吸收可測(cè)定核酸的濃度和純度。一般測(cè)定OD260/OD280,純DNA為1.8,RNA為2.0。如果含有蛋白質(zhì),比值會(huì)明顯下降。純的核酸可以根據(jù)紫外吸收計(jì)算濃度。 紫外吸收改變是DNA結(jié)構(gòu)變化的標(biāo)志,當(dāng)雙鏈DNA解鏈時(shí)堿基外露增加,紫外吸收明顯增加,稱為增色效應(yīng)。雙鏈、單鏈DNA與核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6。 在一定條件下,雙鏈DNA解鏈成為單鏈的現(xiàn)象稱為變性或熔解。加熱引起的變性稱為熱變性;堿性條件(pH>11.3)下,DNA會(huì)發(fā)生堿變性。此外,尿素、有機(jī)溶劑、甚至脫鹽都可引起DNA變性。DNA變性后粘度降低,密度和吸光度升高。 ![]() DNA變性與復(fù)性,引自百度圖片 通常將50%DNA分子變性時(shí)的溫度稱為熔點(diǎn)(Tm)。一般DNA在生理?xiàng)l件下的熔點(diǎn)在85-95度之間。熔點(diǎn)主要取決于堿基組成,G-C對(duì)含量越高,熔點(diǎn)越高。一般G-C對(duì)含量40%時(shí)熔點(diǎn)是87度,每增加1%,熔點(diǎn)增加約0.4度。緩沖液中的離子能與DNA結(jié)合,使其穩(wěn)定,所以離子強(qiáng)度越低,熔點(diǎn)越低,熔解范圍越窄。因此DNA應(yīng)保存在高鹽溶液中。如果DNA不純,則變性溫度范圍也會(huì)擴(kuò)大。甲酰胺可以使堿基對(duì)之間的氫鍵不穩(wěn)定,降低熔點(diǎn)。所以分子生物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用甲酰胺使DNA變性,以避免高溫引起DNA斷裂。乙醇、丙酮、尿素等也可促進(jìn)DNA變性。 除去變性因素后,互補(bǔ)的單鏈DNA又可以重新結(jié)合為雙鏈DNA,稱為復(fù)性或退火。DNA復(fù)性由局部序列配對(duì)形成雙鏈核心的慢速成核反應(yīng)開始,然后經(jīng)過快速的所謂拉鏈反應(yīng)而完成。 DNA的復(fù)性速度與其初始濃度C0及復(fù)雜度有關(guān)。當(dāng)溫度、離子強(qiáng)度等其他條件固定時(shí),一半DNA復(fù)性時(shí)的C0t值僅與其復(fù)雜度有關(guān),可用來計(jì)算基因組的復(fù)雜度。 變性后的單鏈DNA與具有互補(bǔ)序列的其它DNA或RNA分子結(jié)合形成雙鏈的DNA-DNA或DNA-RNA雜合分子的過程稱為分子雜交。實(shí)驗(yàn)室中常用的Southern Blot(DNA雜交)、Northern Blot(RNA雜交)等技術(shù)都是以此為基礎(chǔ)的。分子雜交技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,對(duì)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用。 ![]() Northern Blot原理,引自百度圖片 |
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